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文檔簡介
1、牙齒的萌出依賴于牙囊的存在及牙槽骨的吸收,而其中單核細胞進入牙囊并在其中聚集是牙齒萌出的關鍵。牙齒萌出前,單核細胞遷入牙囊,并分化為破骨細胞吸收牙槽骨以形成牙齒的萌出通道。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)是單核細胞遷入牙囊的主要趨化分子,其基因表達的高峰期位于大鼠出生后第三天,與單核細胞遷入牙囊的時期相一致。 表皮生長因子(EGF)是發(fā)現(xiàn)最早的生長因子之一,分布于人體多種組織中,在上皮的生長、分化、創(chuàng)傷的愈合過程中作用顯著。研
2、究表明,將EGF注射到新生小鼠體內(nèi)可以使切牙早熟性地萌出,因此EGF可能在牙齒萌出過程中發(fā)揮著重要的作用,但其具體的促萌機制尚不清楚。 本實驗擬在通過培養(yǎng)大鼠牙囊細胞,觀察表皮生長因子對牙囊細胞體外增殖的影響,并研究其與單核細胞趨化蛋白-1的關系,探討其在牙槽骨吸收過程中的作用,從而進一步探討牙齒萌出的機理。 方法: 1.細胞培養(yǎng):分離4~6天齡Wistar大鼠的牙囊組織,將組織塊放入a-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),待細
3、胞生長至匯合點后傳代,取生長狀態(tài)良好的3~4代細胞待用。 2.檢測EGF對細胞增殖活性的影響:將生長良好的牙囊細胞以2×104個/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)24h后分別加入EGF(0.5、1、5、10、50ng/ml,與細胞共同孵育3~4天后,用MTT法對比觀察不同濃度的EGF對牙囊細胞增殖活性的影響。 3.檢測EGF對MCP-1表達的影響:將生長良好的牙囊細胞接種于直徑70mm的培養(yǎng)皿中,待細胞生長至匯合點后,用無血清的
4、a-MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)5h,再用10ng/ml濃度的EGF繼續(xù)孵育0、0.5、1、3、6h后終止培養(yǎng),Trizol一步法分別提取總RNA,采用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測同一濃度的EGF作用不同時間后,牙囊細胞MCP-1 mRNA的表達變化。 結果: 1.牙囊組織培養(yǎng)24h后便可見少數(shù)細胞從組織周圍爬出,呈貼壁型生長,14~21天后細胞即可達單層匯合。細胞呈明顯的多形性,主要有兩種細胞形態(tài),一種細胞呈梭形,另一種
5、細胞呈多角形,兩種細胞間雜在一起生長。免疫細胞化學染色顯示細胞的波形蛋白表達陽性,角蛋白表達陰性,表明細胞源自間充質。 2.合適濃度的EGF對牙囊細胞的增殖有明顯的促進作用。在濃度為1ng/ml時開始顯效,5ng/ml時增高,10ng/ml時達到最高,與對照組比較有顯著差異。50ng/ml時增殖率開始降低,且與對照組無顯著性差異。 3.與10ng/ml EGF共同孵育0.5h,牙囊細胞中MCP-1mRNA表達開始升高,3
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