馬流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建.pdf

1、馬流行性感冒是由馬流感病毒引起的馬屬動物的一種急性呼吸道傳染病，世界動物衛(wèi)生組織將馬流感列為法定報告動物疫情之一。馬流感的爆發(fā)曾對我國的養(yǎng)馬業(yè)及賽馬業(yè)造成沉重的經(jīng)濟打擊，因此針對馬流感病毒的基礎(chǔ)研究一直是病毒學(xué)領(lǐng)域研究的重點。
　　本研究以最早分離得到的H3N8亞型馬流感毒株A/equine/Miami/1/1963(H3N8)為親本，通過RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及PCR技術(shù)對流感病毒8條基因片段進行擴增，將擴增后的基因片段同pHW20

2、00雙向表達載體連接，最終得到了8個含有流感病毒不同基因片段的重組質(zhì)粒，完成了馬流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，收獲的細胞上清接種MDCK細胞繼續(xù)進行培養(yǎng)，最終拯救出具有感染活性的病毒粒子rH3N8。對拯救出的rH3N8毒株進行基因序列測定，結(jié)果顯示其各條基因片段的序列均與親本毒株A/equine/Miami/1/1963(H3N8)相同。rH3N8毒株的血凝測定結(jié)果、TCID50測定結(jié)果及病毒生長曲線結(jié)

3、果也均與親本毒株相似。
　　在構(gòu)建好的馬流感病毒反向遺傳系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，以近年本實驗室分離馬流感毒株A/equine/Heilongjiang/SS1/2013(H3N8)為親本，通過RNA抽提、反轉(zhuǎn)錄及PCR技術(shù)對毒株的聚合酶蛋白基因進行了擴增，連接pHW2000雙向表達載體，使用構(gòu)建好的質(zhì)粒對A/equine/Miami/1/1963(H3N8)毒株的聚合酶蛋白基因NP、PA、PB1及PB2進行了替換，質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后拯救出了聚合

4、酶蛋白替換重組病毒tH3N8。tH3N8毒株的測序結(jié)果顯示其基因序列同質(zhì)粒所攜帶序列相同。tH3N8毒株的血凝試驗結(jié)果顯示，其效價變化速率及同期血凝效價結(jié)果均高于rH3N8毒株。TCID50結(jié)果及病毒生長曲線結(jié)果也均反映出tH3N8毒株比rH3N8毒株在MDCK細胞上具有更快的病毒復(fù)制速度。上述結(jié)果暗示著A/equine/Heilongjiang/SS1/2013(H3N8)毒株的聚合酶蛋白相對A/equine/Miami/1/1963