活性氮簇在衰老大鼠心肌組織的含量變化及可能的意義.pdf

1、活性氧簇(Reactive Oxygen Species，ROS)是已知的衰老過程中蛋白修飾和細(xì)胞損傷的重要介質(zhì)。但衰老動(dòng)物心肌細(xì)胞凋亡的增加并不能單一用ROS的產(chǎn)生解釋。近年來大量研究資料表明，源于一氧化氮(Nitric Oxide，NO)的活性氮簇(Reactive Nitrogen Species， RNS)也是蛋白修飾和細(xì)胞損傷的重要介質(zhì)。NO由三種一氧化氮合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthase

2、，eNOS；Inducible Nitric Oxide Synthase，iNOS；Neuronal Nitric Oxide Synthase， nNOS)催化L-精氨酸生成。 大量研究表明RNS具有抗凋亡和抑凋亡的雙重作用，濃度、胞內(nèi)時(shí)空分布、氧化還原狀態(tài)可能是RNS促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡的決定因素。生理狀態(tài)的NO(低濃度的NO)可直接與O<,2>生成NO<,2>，后者再與另-NO反應(yīng)生成N<,2>O<,3>，N<,2>O<,

3、3>可作為NO<'+>供體，使蛋白質(zhì)發(fā)生S-亞硝基化，后者是NO抗凋亡效應(yīng)的主要途徑；而高濃度的NO(如iNOS催化生成的NO)可以與O<,2><'->反應(yīng)生成極為活躍的過氧亞硝基(ONOO<'->)，它可以作為NO<,2><'+>的供體導(dǎo)致蛋白質(zhì)的硝基化，后者是NO致凋亡效應(yīng)的主要途徑。細(xì)胞培養(yǎng)研究證明，衰老的內(nèi)皮細(xì)胞中S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量下降，但衰老心臟心肌細(xì)胞的S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量是否下降，以及衰老的心肌細(xì)胞凋亡增高的原因是否

4、與其RNS的促凋亡和抑凋亡效應(yīng)失調(diào)有關(guān)還未確定。 NO不能直接引起蛋白質(zhì)S-亞硝基化，必需通過NO<'+>供體(N<,2>O<,3>)或NO丟失一個(gè)電子產(chǎn)生NO<'+>來參與這一過程。由于N<,2>O<,3>的生成需要2分子的NO，在細(xì)胞膜中脂溶性的NO與O<,2>更易聚集而生成NO<'+>供體---N<,2>O<'3>，從而使蛋白質(zhì)更易發(fā)生 S-亞硝基化。由于eNOS是唯一與膜相關(guān)的NOS，其含量和活性很可能與蛋白質(zhì)S-亞硝基

5、化密切相關(guān)。有研究資料表明，衰老動(dòng)物及培養(yǎng)的衰老細(xì)胞中eNOS的含量和活性下降，但老年大鼠心肌組織中的eNOS表達(dá)變化報(bào)道不一；此外，eNOS表達(dá)水平是否與S-亞硝基化蛋白質(zhì)含量相關(guān)還不清楚。 方法： (1)分別選取雄性成年(4-6月，n=10)和老年(22-24月，n=16)SD大鼠，設(shè)立成年大鼠組與衰老大鼠組，經(jīng)右側(cè)頸總動(dòng)脈插管進(jìn)入左心室，監(jiān)測(cè)心率、左心室壓力、左心室壓力變化最大速率和心肌收縮指數(shù)(Cardiac I

6、ndex，CI)等心功能指標(biāo)； (2)分別采用原位末端標(biāo)記法(Terminal deoxynucleotidyl Transferase-mediated dUTP Nick End Labeling，TUNEL)和caspase-3活性測(cè)定法檢測(cè)心肌組織中細(xì)胞凋亡發(fā)生情況： (3)采用免疫組化方法檢測(cè)心肌組織中的S-亞硝基化的蛋白質(zhì)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的分布及含量； (4)利用NitroGlo試劑盒

7、(PerkinElmer)檢測(cè)心肌組織中S-亞硝基化的蛋白質(zhì)表達(dá)水平； (5)用Western-blot法檢測(cè)心肌組織中eNOS和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)的表達(dá)； (6)硝基酪氨酸(Nitrotyrosine，NT)是體內(nèi)生成過氧亞硝基(ONOO<'->)的標(biāo)志物，用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)檢測(cè)NT的表達(dá)。 結(jié)論：

8、1.衰老大鼠心肌細(xì)胞凋亡增加、心臟相對(duì)質(zhì)量下降、心功能明顯降低； 2.衰老大鼠心肌組織中，具有細(xì)胞毒性的ONOO<'->大量生成，而保護(hù)心肌細(xì)胞的S-亞硝基化的蛋白質(zhì)含量下降，減弱其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用。因此，衰老大鼠心肌組織中促凋亡和抑凋亡RNS的失衡，有可能通過促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致心肌細(xì)胞丟失，最終造成心臟收縮和舒張功能的下降。 3.與成年大鼠相比，衰老大鼠心肌組織中iNOS表達(dá)明顯增高：同時(shí)，eNOS表達(dá)明顯下