陰道毛滴蟲有癥狀及無癥狀株黏附蛋白33基因的克隆、序列比較和表達研究.pdf

1、研究背景及目的：陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis,Tv)是一種單細胞真核生物型原蟲，寄生于人體泌尿生殖道，可引起陰道毛滴蟲病(Trichomoniasis)。陰道毛滴蟲病已被列為人類常見性傳播疾病之一。據(jù)不完全統(tǒng)計，世界每年約有1億2千萬患者，隨著世界各地流動人口的增加，滴蟲感染率呈逐年上升趨勢。研究發(fā)現(xiàn)，陰道毛滴蟲的感染可增加人體對其它病原體(如人類免疫缺陷病毒)的易感性<'[1]>，故受到越來越多的關(guān)注。陰道毛

2、滴蟲對人體泌尿生殖道靶上皮細胞的黏附是蟲體感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而這一環(huán)節(jié)是黏附分子(adhesion protein，AP)介導(dǎo)的接觸依賴性過程。就目前的研究而言，滴蟲細胞表面有4種黏附分子參與了這一過程，分別是AP23，AP33，AP51．AP65。AP33蛋白是定位于細胞膜上非常重要的一種黏附分子，從其分子結(jié)構(gòu)來看，N-末端約72個氨基酸的區(qū)域和C-末端24個氨基酸的區(qū)域可以和宿主細胞相互反應(yīng)，介導(dǎo)了滴蟲的黏附，用抗滴蟲的mAb主要與A

3、P33蛋白C-末端約28個氨基酸區(qū)域有免疫反應(yīng)性，該研究證明了AP33蛋白的黏附作用及免疫反應(yīng)性的存在。該蛋白由AP33蛋白基因編碼，為單拷貝基因，存在3種類型，分別為ap33-1， ap33-2，ap33-3，該基因在序列上有很大的保守性，已有研究表明：該基因是一種較好的遺傳標志。陰道毛滴蟲在長期的生物進化過程中，形成不同種、亞種和不同株，不同分離株在遺傳上具有不同的特征，在此基礎(chǔ)上，陰道毛滴蟲與宿主相互作用過程中可形成不同的表型。臨

4、床上滴蟲感染者可表現(xiàn)為滴蟲病、帶蟲者等多種情況。國內(nèi)外很多學(xué)者對兩株滴蟲進行分離培養(yǎng)并進行動物和細胞學(xué)實驗，均證實兩株滴蟲在致病力上存在一定的差異，而表型的差異是由基因的差異所引起的，ap33基因作為一種較好的遺傳學(xué)標志可為比較兩株滴蟲基因是否存在差異提供參考。研究ap33基因的克隆、序列比較及表達有利于進一步研究AP33蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，認清陰道毛滴蟲的致病機制，為滴蟲的防治打下理論基礎(chǔ)，也可為種內(nèi)亞型提供理論依據(jù)。本研究分兩部分：

5、 第一部分：陰道毛滴蟲有癥狀及無癥狀株黏附蛋白33基因的克隆和序列比較 目的：有癥狀株及無癥狀株黏附蛋白33基因的克隆和序列比較。 方法：分離和培養(yǎng)我國四川地區(qū)陰道毛滴蟲有癥狀株(陰道毛滴蟲四川分離株-2)及無癥狀株(陰道毛滴蟲四川分離株-3)，有機法提取滴蟲基因組DNA，根據(jù)GenBank上提供的ap33基因序列，設(shè)計3對特異性引物，以DNA為模板，對滴蟲四川分離株ap33基因進行PCR預(yù)擴增，確定ap33基因類

6、型，再行特定ap33基因大量擴增，純化后克隆入PMD-18T線性載體，PCR法及限制性酶切法對重組質(zhì)粒進行鑒定，并對ap33基因進行序列測定和比較。 結(jié)果：成功構(gòu)建ap33基因克隆載體，經(jīng)鑒定和序列測定，四川地區(qū)陰道毛滴蟲有癥狀株及無癥狀株的ap33基因類型均為ap33-1，編碼區(qū)全長930 bp，與國際標準株的同源性均達到99％，兩株滴蟲ap33基因存在3對堿基的差異。 第二部分：陰道毛滴蟲有癥狀株黏附蛋白33基因的原

7、核表達及真核表達載體的構(gòu)建 目的：構(gòu)建ap33基因原核表達質(zhì)粒并誘導(dǎo)表達，構(gòu)建真核表達質(zhì)粒。 方法：將含有第一部分構(gòu)建的滴蟲有癥狀株重組質(zhì)粒pMD-18T-ap33及pUC18、pcDNA3.1(+)的甘油保種菌液劃線接種于固體培養(yǎng)基，挑取單菌落接種于液體培養(yǎng)基， 37℃振蕩培養(yǎng)過夜后，用日常型質(zhì)粒提取試劑盒分別提取3種質(zhì)粒，分別對3種質(zhì)粒進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切完全后，切膠，DNA純化試劑盒純化回收所需DNA

8、片段，將ap33基因片段定向克隆入pUC18、pcDNA3.1(+)載體中，重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及雙酶切鑒定。重組質(zhì)粒pUC18-ap33經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，采用SDS-PAGE電泳及Western-blot方法鑒定蛋白質(zhì)表達情況。 結(jié)果：經(jīng)PCR．及酶切鑒定，重組質(zhì)粒pUC18-ap33、pcDNA3.1(+)-ap33為正確重組子。 pUCl8-ap33經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達出約Mr 36 000大小的蛋白質(zhì)，與理論值相符。 結(jié)