Hedgehog 信號轉(zhuǎn)導分子在體外誘導大鼠基質(zhì)干細胞成軟骨和成骨細胞過程中作用的研究.pdf

1、目前，由于機械、外力或自身因素引起的骨及軟骨損傷已成為臨床治療的主要病癥之一?，F(xiàn)階段利用組織工程進行骨修復是骨組織缺損治療的熱點和發(fā)展方向。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchy stem cell，BMSCs)作為一類存在于骨髓中的非造血多能干細胞，具有自我更新、多向分化的特性，而且來源廣、取材簡便、免疫排斥反應弱、遺傳背景穩(wěn)定，已成為組織工程中首選的種子細胞。許多研究已經(jīng)證實，BMSCs可分化為成骨細胞、軟骨細胞

2、等多種細胞，因而被廣泛應用于治療骨組織缺損。但是BMSCs向成骨細胞以及軟骨細胞分化的誘導條件尚無標準，常用的成骨誘導劑是地塞米松，軟骨誘導劑是TGF-β1。
　　在脊椎動物中，Hedgehog(Hh)蛋白家族包括3個成員:Sonic Hedgehog(SHH)、Indian Hedgehog(IHH)和Dersert Hedgehog(DHH)。SHH與細胞在肢體、體節(jié)、神經(jīng)管發(fā)育中的分化建立有關(guān)，IHH特征性地參與軟骨發(fā)育，D

3、HH在生殖細胞的發(fā)育中起關(guān)鍵作用。Hedgehog信號通路不但在骨組織發(fā)育過程中起重要的調(diào)控作用，也可以促進成骨相關(guān)細胞的分化。
　　BMSCs在骨髓中含量很少并且迄今為止仍未篩選到它的特異性分子標記，在體外培養(yǎng)的環(huán)境中如何提純并富集BMSCs問題還沒有解決。而且在高等動物體內(nèi)，Hedgehog在骨、軟骨發(fā)育中的作用機制研究較清楚，但其在骨組織工程中(由種子細胞定向分化為軟骨和骨細胞的過程)的作用及機理尚不清楚。因此，本文采用貼壁

4、分離法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，用含有地塞米松的成骨誘導液誘導其向成骨細胞分化，用含TGF-β1的軟骨誘導液誘導其向軟骨細胞分化。采用RT-PCR、免疫組化及Western Blotting等方法檢測分析BMSCs向成骨、軟骨分化過程中信號分子SHH和IHH在蛋白水平以及基因水平的表達變化，以探討Hedgehog信號分子在體外誘導BMSCs成骨分化和軟骨分化過程中的作用。
　　本研究主要有以下研究結(jié)果:
　　1、利用直接貼壁

5、分離法分離大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，比較四種培養(yǎng)環(huán)境發(fā)現(xiàn)，用進口胎牛血清和DMEM-L培養(yǎng)液培養(yǎng)于一次性塑料培養(yǎng)皿中，細胞生長狀態(tài)最好、細胞增殖速度最快。傳至第3代，即可見絕大數(shù)細胞為長梭形的成纖維樣細胞，呈漩渦狀生長。流式細胞術(shù)檢測第3代細胞CD44和CD34的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含有CD44的細胞數(shù)占總數(shù)的90.16％，而含有CD34的細胞數(shù)占總數(shù)的2.27％。
　　2、地塞米松誘導7d、14d、21d后，I型膠原陽性表達率逐漸升高

6、，且從14d開始陽性率高于90％。SHH蛋白在誘導組較同時段未誘導組表達量顯著增加(P＜0.05)，隨著誘導時間的延長SHH蛋白的表達量先升后降，其中14d時SHH表達量最高。IHH蛋白在誘導組表達量顯著低于未誘導組(P＜0.05)，隨著誘導時間的延長 IHH蛋白的表達量無顯著變化。在MSCs誘導成成骨過程中Shh基因和Ihh基因的表達無顯著性變化(P＞0.05)。
　　3、TGF-β1誘導7d、14d、21d后，Ⅱ型膠原陽性表達

7、率逐漸升高，從14d開始陽性率高于90％。SHH蛋白在誘導組較同時段未誘導組表達量顯著降低(P＜0.05)，但隨著誘導時間的延長SHH蛋白的表達量顯著增加(P＜0.05)。IHH蛋白在誘導14d和21d時表達量較未誘導組顯著增高(P＜0.05)，且隨著誘導時間的延長 IHH蛋白的表達量顯著增加(P＜0.05)。Shh基因表達量的變化趨勢與SHH蛋白的相似。Ihh基因的表達量在誘導7d和14d時顯著低于未誘導組(P＜0.05)，且Ihh基

8、因隨誘導時間的延長表達呈增加趨勢，誘導21d后顯著增加(P＜0.05)。
　　鑒于上述一系列新發(fā)現(xiàn)，可以得出以下主要結(jié)論:
　　1、貼壁分離法分離BMSCs后，用進口胎牛血清和DMEM低糖培養(yǎng)液培養(yǎng)于一次性進口塑料培養(yǎng)皿的方法獲得BMSCs的效率高、純度高，可直接用于后續(xù)研究。
　　2、誘導組Ⅰ型膠原免疫反應呈陽性結(jié)果表明，地塞米松能誘導BMSCs向成骨細胞分化。在誘導組中，SHH蛋白表達較未誘導組顯著升高，IHH蛋白

9、的表達較未誘導組顯著降低，即SHH蛋白與成骨細胞分化呈正相關(guān)，IHH呈負相關(guān)，表明SHH、IHH以不同的作用方式參與間充質(zhì)干細胞誘導成成骨細胞的過程。
　　3、誘導組Ⅱ型膠原免疫反應呈陽性結(jié)果表明，TGF-β1能誘導BMSCs向軟骨細胞分化。在誘導組中，SHH蛋白表達較未誘導組顯著降低，IHH蛋白表達在誘導14d后較未誘導組顯著升高，即SHH蛋白與成軟骨細胞分化呈負相關(guān)，IHH呈正相關(guān)，表明SHH、IHH以不同的作用方式參與間充質(zhì)

10、干細胞誘導成軟骨細胞的過程。
　　綜上所述，本文首次系統(tǒng)的研究Hedgehog信號途徑主要分子(SHH、IHH)在BMSCs定向分化為軟骨和骨細胞的過程中的作用及機理。研究結(jié)果顯示在成骨誘導分化過程中，SHH蛋白的表達顯著升高，IHH蛋白的表達顯著降低；在軟骨誘導分化過程中，SHH蛋白的表達顯著降低，IHH蛋白的表達顯著升高，表明在BMSCs定向分化為軟骨和骨細胞的過程中，可能存在不同SHH信號、IHH信號表達模式，本研究將為闡明