5—氨基乙酰丙酸介導光動力學治療人胃癌的實驗研究.pdf

1、胃癌為我國高發(fā)腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤首位。胃癌早期診斷困難，多數(shù)病例在確診時已屬中晚期，手術治療的5年生存率僅為20％～30％。近年來雖然出現(xiàn)了各種手術方式的改良及化療、放療方案的改進，但收效甚微。手術切除無法清除所有的腫瘤細胞，且存在術后復發(fā)和轉移的弊端。而放、化療的副反應大，療效亦不甚理想。近年來，隨著光動力治療(photodynamictherapy,PDT)技術的發(fā)展，加上纖維內窺鏡和激光技術的不斷改進，PDT療法

2、為早、晚期胃癌的根治、姑息治療都提供了新模式。腫瘤光動力治療(PDT)是80年代初興起、并在近年發(fā)展起來的一種新的治療腫瘤的方法，即利用腫瘤組織對特定化學物質的選擇性攝入，這些特定的化學物質在一定波長的光作用下產生光動力效應而達到破壞腫瘤組織的目的。光動力治療的這種選擇性殺傷腫瘤細胞、局部治療的特性非常適合消化系統(tǒng)腫瘤的輔助治療。光動力學治療的核心問題是光敏劑問題。目前在臨床上廣泛應用得光敏劑是血卟啉衍生物(HPD)。HPD雖然在腫瘤的

3、臨床診斷和治療中都取得了肯定的療效，但仍有很多不足之處：作用光譜不理想；對組織的穿透能力較差；給藥至光照的時間間隔長;用藥前需皮試；價格昂貴；特別是皮膚光敏副作用較大，可持續(xù)至治療后六周。 第一章5－氨基乙酰丙酸介導的人胃癌細胞光動力學治療 目的： 探索新一代光敏劑5-ALA介導的PDT對人胃癌細胞的體外殺傷作用，及最佳用藥劑量、最佳用藥時間等。 方法： 1.光敏劑原卟啉在細胞內的定位：常規(guī)爬片法

4、培養(yǎng)MGC-803人胃癌細胞并給予2mmol/L的5-ALA孵育6小時，熒光倒置顯微鏡及共聚焦顯微鏡下觀察。 2.光敏劑原卟啉的測定；對數(shù)期生長的MGC-803細胞，給予固定濃度的5-ALA培養(yǎng)不同的時間及固定時間、不同的濃度5-ALA培養(yǎng)，達到孵育時間后，用熒光分光光度計測量各細胞懸液熒光強度。 3.腫瘤集落形成實驗：雙層軟瓊脂培養(yǎng)法分別培養(yǎng)單純MGC-803細胞組、單純5-ALA組、單純激光組、光動力學治療組的細胞。

5、 4.5-ALA孵育時間對其介導PDT的影響：使用相同濃度的5-ALA培養(yǎng)不同時間的MGC-803胃癌細胞，給予相同劑量的激光輻照，MTT法測定細胞存活率。 5.5-ALA濃度對其介導PDT的影響：使用不同濃度的5-ALA培養(yǎng)相同時間的MGC-803人胃癌細胞，給予相同劑量的激光輻照，MTT法測定細胞存活率。 6.激光能量對5-ALA介導PDT對細胞殺傷力的影響：使用相同濃度的5-ALA培養(yǎng)相同同時間的MGC-8

6、03人胃癌細胞，給予不同劑量的激光輻照，MTT法測定細胞存活率。 7.5-ALA本身對MGC-803細胞的影響：使用不同濃度的5-ALA培養(yǎng)相同時間的MGC-803胃癌細胞，不予激光輻照，MTT法測定細胞存活率。 8.單用激光輻照對MGC-803細胞的影響：不給予5-ALA、培養(yǎng)相同時間的MGC-803胃癌細胞，給予不同劑量的激光輻照，MTT法測定細胞存活率。 結論： 1.5-ALA與MGC-803人胃癌

7、細胞共同培養(yǎng)，可以產生光敏劑原卟啉PpⅨ。 2.光敏劑原卟啉PpⅨ位于細胞的胞漿、胞膜，胞核未見PpⅨ產生。 3.5-ALA與MGC-803細胞共同培養(yǎng)所產生的光敏劑PpⅨ的量在孵育6小時可達最高峰，并隨著5-ALA的濃度的增加而增加，但在2.00mmol/L時出現(xiàn)飽和。 4.在小劑量下，單純給予5-ALA及單純給予激光都不能明顯改變MGC-803腫瘤細胞的無限增殖的生物學特性。而5-ALA介導的光動力學治療卻明

8、顯地阻止了MGC-803腫瘤細胞的無限增殖形成集落的能力。 5.5-ALA介導的PDT對MGC-803胃癌細胞具有殺傷作用，最佳孵育時間為6小時，最佳藥物濃度為2.00mmol/L。5-ALA本身對細胞無明顯毒性作用。 第二章5－氨基乙酰丙酸介導的光動力學治療對裸鼠人胃癌移植瘤作用的研究 目的： 探索5-ALA介導的光動力學治療對裸鼠人胃癌移植瘤的作用。 方法： 1.以MGC-803人胃癌

9、細胞制備裸鼠人胃癌移植瘤模型。 2.人胃癌移植瘤的荷瘤裸鼠腫瘤直徑達到0.6cm時，腹腔注射無血清1640培養(yǎng)液配制的5-ALA溶液100mg/kg，6小時后置整體熒光成像系統(tǒng)下觀察采集動物瘤體發(fā)出的熒光信號。 3.測量荷瘤對照組、單純激光組、單純5-ALA組、5-ALA介導的PDT治療組四組治療后第1、3、7、14、21的裸鼠腫瘤大小并計算腫瘤體積，末次測量后處死裸鼠，切除腫瘤稱重并行病理檢查。 結論：

10、 5-ALA介導的光動力學治療對于裸鼠人胃癌移植瘤具有明顯的治療效果，而單純給予5-ALA及單純給予激光輻射沒有明顯的抑制作用。 第三章5－氨基乙酰丙酸介導的光動力治療人胃癌機制的研究 目的： 探索5－氨基乙酰丙酸介導的光動力學治療胃癌的可能機制。 方法： 1.常規(guī)爬片法培養(yǎng)MGC-803人胃癌細胞，隨機分為單純MGC-803細胞組、單純5-ALA組、單純給予激光組、光動力學治療組。使用Hoech

11、st33258凋亡檢測、AO-EB染色法檢測細胞凋亡。 2.收集單純MGC-803細胞組、單純5-ALA組、單純給予激光組、光動力學治療組各組細胞行Annexin-V-PI流式細胞術分析。 3.收集上述四組細胞行透射電鏡觀察。 4.荷瘤對照組、單純激光組、單純5-ALA組、5-ALA介導的PDT治療組裸鼠腫瘤組織行MDA含量測定。 5.上述四組裸鼠腫瘤組織行透射電鏡觀察。 6.上述四組裸鼠腫瘤組織

12、使用TUNEL法檢測組織細胞凋亡。 7.在原卟啉溶液中加入不同濃度的NaN3，觀測NaN3濃度對光敏劑原卟啉光漂白的影響。 結果： 1、5-ALA介導的光動力學對人MGC-803胃癌細胞的作用 (1)Hoechst33258凋亡染色法、AO-EB染色法均發(fā)現(xiàn)只有光動力學治療組有細胞凋亡現(xiàn)象，而單純MGC-803細胞組、單純5-ALA組、單純給予激光組細胞基本無凋亡細胞。 (2)細胞透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)

13、光動力學治療組在存在大量死亡細胞的同時有部分凋亡細胞，而其他組細胞表現(xiàn)基本正常。 (3)Annexin-V-PI染色法流式細胞術定量分析示：單純MGC-803細胞組、單純5-ALA組、單純給予激光組、光動力學治療組四組的壞死率分別為1.15％±0.020％、1.18％±0.015％、1.12％±0.021％、56.49％±0.593％(F=26009.8P=0.0000)；凋亡率分別為2.34％±0.038％、2.40％±0.0

14、42％、2.34％±0.036％、21.21％±1.095％(F=885.90P=0.0000)；凋亡+壞死率分別3.49％±0.021％、3.58％±0.026％、3.45％±0.038％、77.70％±0.763％(F=28262.79P=0.0000)?？梢姡核慕M凋亡率、壞死率、凋亡+壞死率都有顯著性差異。其中光動力學治療組的凋亡率、壞死率、凋亡+壞死率都比其他三組顯著高。并且在光動力學治療組壞死率顯著高于凋亡率。 2、人

15、胃癌移植瘤裸鼠腫瘤組織的檢測 (1)荷瘤裸鼠腫瘤組織MDA(丙二醛)測定：荷瘤對照組、單純激光組、單純5-ALA組、5-ALA介導的PDT治療組四組腫瘤組織的MDA含量有顯著性差異(F=17.59P=0.0000)；5-ALA介導的PDT治療組的MDA含量顯著高于其他三組。提示5-ALA介導的PDT是通過光敏劑產生的活性氧物質殺傷腫瘤細胞，含有Ⅰ型活性氧物質產生機制。 (2)腫瘤組織透射電鏡觀察：5-ALA介導的PDT治

16、療組存在大量死亡細胞及部分凋亡細胞，而其他組細胞表現(xiàn)基本正常。 (3)裸鼠腫瘤組織細胞凋亡的檢測(TUNEL法)測定：荷瘤對照組、單純激光組、單純5-ALA組、5-ALA介導的PDT治療組四組腫瘤組織的凋亡指數(shù)分別為1.14％±0.17％、1.07％±0.18％、1.18％±0.09％、18.91％±9.56％，有顯著性差異(x2=18.237P=0.000)；5-ALA介導的PDT治療組的凋亡指數(shù)顯著高于其他三組。 3

17、、NaN3濃度對原卟啉PpⅨ光漂白的影響： 在同樣的條件下，五組原卟啉溶液加入不同濃度的NaN3在不同時間點的OD值(原卟啉PpⅨ濃度)曲線提示五條曲線的下降速度顯著不同(F=112034.8P=0.000)，隨著NaN3濃度的增高，曲線下降的幅度減小。提示NaN3對PpⅨ的光漂白有明顯的抑制作用，說明在PpⅨ的光敏化反應中，有單線態(tài)氧的產生，包含有Ⅱ型活性氧物質產生機制。 結論： 5-ALA介導的光動力學治療能