面神經(jīng)離斷傷后核團(tuán)微環(huán)境中NG2蛋白表達(dá)和NG2陽性細(xì)胞反應(yīng)的研究.pdf

1、研究背景：面神經(jīng)位置表淺，出顱后行程復(fù)雜易變，各種外傷或鄰近部位的手術(shù)均易造成其損傷，導(dǎo)致部分性或完全性面癱，嚴(yán)重影響功能和外觀。盡管目前各種神經(jīng)修復(fù)技術(shù)日趨精益，但臨床觀察發(fā)現(xiàn)術(shù)后神經(jīng)功能的恢復(fù)難臻滿意。究其主要原因，面神經(jīng)損傷后不但外周神經(jīng)干發(fā)生退行性變，而且中樞核團(tuán)內(nèi)也發(fā)生了極為復(fù)雜的反應(yīng)。神經(jīng)元核團(tuán)微環(huán)境的營養(yǎng)和導(dǎo)向作用對(duì)受損神經(jīng)的有效再生具有重要意義。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布，對(duì)神經(jīng)元起物理支持、提供營養(yǎng)、維持周遭

2、液體環(huán)境穩(wěn)定、形成髓鞘、絕緣保護(hù)、清除病原體和死亡神經(jīng)元等多種作用。因此，加強(qiáng)對(duì)面神經(jīng)損傷后核團(tuán)內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境的認(rèn)識(shí)，可以為其修復(fù)再生提供一定的理論基礎(chǔ)。目前，已有大量實(shí)驗(yàn)研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞在面神經(jīng)離斷后核團(tuán)區(qū)發(fā)生了一系列的反應(yīng)。然而，對(duì)于近來發(fā)現(xiàn)的，同樣廣泛存在于CNS中，能對(duì)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷作出強(qiáng)烈反應(yīng)的NG2陽性細(xì)胞，在面神經(jīng)核團(tuán)區(qū)生理和病理情況下均未見研究報(bào)道。而且這類細(xì)胞的功能和作用尚未明確，并在來

3、源屬性上存在極大爭議。本課題擬對(duì)面神經(jīng)損傷后核團(tuán)膠質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境中的NG2蛋白表達(dá)和NG2陽性細(xì)胞的反應(yīng)加以研究，并明確其來源屬性，探討其對(duì)受損神經(jīng)元的作用，為面神經(jīng)損傷后的神經(jīng)元的保護(hù)提供一定的理論基礎(chǔ)。
　　 目的：(1)建立大鼠面神經(jīng)莖乳孔處壓榨、切斷、抽脫模型，系統(tǒng)比較不同受損模式下面神經(jīng)元變化的差異，為針對(duì)不同研究目的選擇動(dòng)物模型提供依據(jù)；(2)觀測面神經(jīng)離斷術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)核團(tuán)內(nèi)NG2蛋白的表達(dá)變化，比較NG2陽性細(xì)胞與

4、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)差異；(3)探討面神經(jīng)離斷后核團(tuán)內(nèi)NG2陽性細(xì)胞的來源和屬性；(4)探討面神經(jīng)核團(tuán)內(nèi)反應(yīng)性增殖的NG2陽性細(xì)胞對(duì)受損神經(jīng)元的可能性作用。
　　 方法：(1)建立大鼠面神經(jīng)莖乳孔處壓榨、切斷、抽脫模型，按術(shù)后1天、2天、7天、14天、28天分組；(2)術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的大鼠灌注、固定后，取包含面神經(jīng)核團(tuán)區(qū)的腦干部位行系統(tǒng)連續(xù)冰凍切片；(3)不同模型不同時(shí)間點(diǎn)的冰凍切片，行Cresyl Violet染色，

5、顯微鏡下拍照后，觀察正常側(cè)和受損側(cè)核團(tuán)內(nèi)面神經(jīng)元空間形態(tài)學(xué)上的不同，并比較不同模型中受損神經(jīng)元的差異；(4)行ChAT免疫組化染色，對(duì)核團(tuán)區(qū)陽性神經(jīng)元進(jìn)行計(jì)數(shù)，并以每只動(dòng)物一套切片手術(shù)側(cè)與對(duì)照側(cè)陽性神經(jīng)元總數(shù)的比值表達(dá)活性神經(jīng)元比率，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；(5)Western Blot法檢測各組不同時(shí)間點(diǎn)兩側(cè)核團(tuán)區(qū)的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)，并根據(jù)掃描的密度值行半定量數(shù)據(jù)分析，得出各樣本的Caspase-3/β-actin的值(均

6、數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)，對(duì)各組各時(shí)間點(diǎn)手術(shù)側(cè)和對(duì)照側(cè)的值行student-t檢驗(yàn)，P＜0.05，認(rèn)為有顯著性差異；(6)Western Blot法檢測面神經(jīng)離斷后核團(tuán)內(nèi)NG2蛋白表達(dá)，并用上述統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析其時(shí)相性變化；(7)應(yīng)用免疫組化的方法，觀察面神經(jīng)離斷術(shù)后核團(tuán)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和NG2陽性細(xì)胞的反應(yīng)，并比較其差異；(8)通過BrdU增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)合免疫熒光雙標(biāo)染色方法，分析NG2陽性細(xì)胞的來源、屬性及作用；(9)建立大鼠

7、頂葉針刺傷異位模型，注射熒光乳膠紅顆粒，術(shù)后1天、2天、7天行免疫熒光染色觀察NG2陽性細(xì)胞的吞噬功能。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成功構(gòu)建了面神經(jīng)莖乳孔處壓榨、切斷、抽脫傷模型；早期動(dòng)物行為學(xué)上均表現(xiàn)為完全性面癱；隨后壓榨組在28天內(nèi)面神經(jīng)功能自行恢復(fù)，而切斷組和抽脫組呈現(xiàn)永久性面癱。
　　 (2)Cresyl Violet染色顯示，壓榨組僅在術(shù)后早期出現(xiàn)面神經(jīng)元尼氏體的不均勻深染，切斷組則表現(xiàn)出程度不同的凋亡

8、前形態(tài)變化，而抽脫組在術(shù)后14天、28天時(shí)出現(xiàn)了凋亡神經(jīng)元。
　　 (3)ChAT免疫組化染色結(jié)果表明，壓榨組僅在術(shù)后7天左右出現(xiàn)神經(jīng)元合成和釋放乙酰膽堿遞質(zhì)能力的減弱，隨后逐漸恢復(fù)；切斷組和抽脫組活性神經(jīng)元比率則逐步降低，與壓榨組相比存在著明顯的組間差異(P＜0.05)。
　　 (4)Caspase-3 Western Blot結(jié)果顯示，壓榨組雙側(cè)核團(tuán)區(qū)Caspase-3表達(dá)無明顯差異，均處在較低水平，而切斷組在術(shù)后7

9、天，抽脫組在術(shù)后2天開始受損側(cè)與正常側(cè)相比出現(xiàn)高表達(dá)(P＜0.05)，并在28天內(nèi)呈逐步增高趨勢。
　　 (5)應(yīng)用Western Blot方法，首次證實(shí)了面神經(jīng)核團(tuán)內(nèi)存在NG2蛋白的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)在面神經(jīng)離斷術(shù)后28天內(nèi)，受損側(cè)核團(tuán)內(nèi)NG2蛋白呈現(xiàn)規(guī)律時(shí)相性變化(術(shù)后第2天起逐漸增高，7天時(shí)達(dá)峰值，隨后逐漸下降，在28天左右降至基線水平)。
　　 (6)免疫組化染色結(jié)果顯示，面神經(jīng)離斷術(shù)后小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和NG2

10、陽性細(xì)胞均發(fā)生了明顯的反應(yīng)。NG2陽性細(xì)胞在術(shù)后2天胞體增大，突起變粗，NG2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，并逐漸增殖遷移；在7天左右時(shí)對(duì)受損神經(jīng)元形成了類似于小膠質(zhì)細(xì)胞的緊密包繞，而這種包繞明顯不同于星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)受損神經(jīng)元所形成的疏松花環(huán)樣簇?fù)怼?br>　　 (7)應(yīng)用免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù)發(fā)現(xiàn)，面神經(jīng)離斷后核團(tuán)內(nèi)的NG2陽性細(xì)胞由兩種屬性的細(xì)胞組成：1、核團(tuán)內(nèi)固有的NG2陽性細(xì)胞，這部分細(xì)胞屬于傳統(tǒng)觀念上的OPC。本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為NG2+/PDGF

11、-α-R+/OX42-或NG2+/PDGF-α-R+/Lectin-，但其對(duì)面神經(jīng)離斷傷無明顯反應(yīng)；2、誘導(dǎo)表達(dá)了NG2的活化小膠質(zhì)細(xì)胞，這種細(xì)胞在面神經(jīng)離斷傷后2天逐步出現(xiàn)，并進(jìn)一步活化增殖，細(xì)胞數(shù)目在術(shù)后7天達(dá)到峰值，并同時(shí)對(duì)受損神經(jīng)元形成了緊密包繞。
　　 (8)對(duì)這種表達(dá)NG2蛋白的活化小膠質(zhì)細(xì)胞的功能進(jìn)行初步分析發(fā)現(xiàn)，NG2陽性突起伸入到受損神經(jīng)元的輸入或輸出突觸間隙之間，對(duì)Synapsin-I標(biāo)示的突觸末端進(jìn)行了廣泛

12、的剝離。而其NG2蛋白的表達(dá)能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和粘附。進(jìn)而通過異位模型，證實(shí)這種活化的小膠質(zhì)細(xì)胞并不像普通意義下激活的小膠質(zhì)細(xì)胞具有吞噬能力。
　　 結(jié)論：
　　 (1)通過對(duì)面神經(jīng)莖乳孔處壓榨、切斷、抽脫三種損傷模型的比較研究發(fā)現(xiàn)，切斷組核團(tuán)區(qū)大量神經(jīng)元功能失活，但并沒有發(fā)生徹底性死亡，僅僅是發(fā)生凋亡前變化。在術(shù)后28天內(nèi)進(jìn)入了功能上的“休眠”狀態(tài)，這與核團(tuán)區(qū)的膠質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境變化存在著很大的關(guān)系。
　　

13、(2)研究面神經(jīng)切斷后膠質(zhì)細(xì)胞微環(huán)境，首次發(fā)現(xiàn)核團(tuán)區(qū)NG2蛋白的規(guī)律時(shí)相性變化，并證實(shí)其表達(dá)并非作為分泌型蛋白參與膠質(zhì)瘢痕的形成，而是表達(dá)于一類特殊細(xì)胞群體表面，作為其活化的標(biāo)志。
　　 (3)對(duì)反應(yīng)性NG2陽性細(xì)胞來源和屬性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)面神經(jīng)離斷傷后出現(xiàn)的反應(yīng)性NG2陽性細(xì)胞并非傳統(tǒng)意義上的OPC，而是誘導(dǎo)表達(dá)了NG2的活化小膠質(zhì)細(xì)胞，這種細(xì)胞在面神經(jīng)離斷傷后2天逐步出現(xiàn)，并進(jìn)一步活化增殖遷移，對(duì)受損神經(jīng)元形成了緊密包繞。<