芪合酶基因的克隆及其對甜瓜的遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、白黎蘆醇在結(jié)構(gòu)分類上屬于芪類，是芪類最重要的活性成分之一。人們很早就發(fā)現(xiàn)含有芪類的樹木不易腐爛，所以芪類有“植物殺菌素”之稱?，F(xiàn)代藥理實驗表明，白黎蘆醇具有廣泛的生理活性和多種保健功能，對芪類成分的研究是當(dāng)今人們在植物抗病性和植物保健品開發(fā)中十分關(guān)注的課題。白藜蘆醇和其它芪類化合物的生物合成屬于次生代謝，是通過苯丙氨酸代謝途徑合成的。其中最關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶是芪合酶。 白藜蘆醇僅存在于葡萄、花生等少數(shù)植物體內(nèi)。一般植物體內(nèi)雖然含有芪合

2、酶的底物，但沒有芪合酶基因而不能合成白藜蘆醇。應(yīng)用芪合酶基因轉(zhuǎn)化植物從而提高植物抗病性和品質(zhì)越來越受到重視。 虎杖為蓼科多年生草本植物，是到目前為止人們發(fā)現(xiàn)的自然界中含白藜蘆醇最高的植物；羊蹄甲是豆科綠化樹種，果莢中亦含有白藜蘆醇。 甜瓜為葫蘆科一年生蔓性草本植物，其果實營養(yǎng)豐富、風(fēng)味獨特、香甜可口，深受人們喜愛，被列入世界十大水果之一。我國是甜瓜第一生產(chǎn)大國，約占世界總面積和總產(chǎn)量的一半。目前我國甜瓜主要分為薄皮甜瓜和

3、厚皮甜瓜兩大系列。 從1983年世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物問世以來，轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速發(fā)展，為培育出高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲、抗逆境的優(yōu)良品種開辟了新途徑，并已取得重大突破，產(chǎn)生了巨大的社會和經(jīng)濟效益。但該技術(shù)在瓜類作物中的應(yīng)用研究起步較晚，加之甜瓜存在組培再生成苗率低和遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立較難等問題，因而轉(zhuǎn)基因研究較為落后。 本論文主要試驗結(jié)果和結(jié)論如下：1.測定了若干果樹的果實及藥用植物中白藜蘆醇的含量本研究對十幾種果樹的果實進行檢

4、測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在桑椹、菠蘿、蒲桃、葡萄、假檳榔等的果實中含有白黎蘆醇。其含量的高低趨勢是：桑椹＞菠蘿＞蒲桃＞葡萄＞假檳榔。因此，從食用果實角度利用自黎蘆醇的保健作用來看，桑椹、菠蘿和蒲桃比葡萄價值更高，將有較好的開發(fā)應(yīng)用前景。 虎杖作為一種中藥材，其藥用部分為多年生根，因此對虎杖藥用成分及價值的研究幾乎都集中在根上，本試驗測得虎杖葉片中的白藜蘆醇含量甚高，為764.74μg/g，葉片產(chǎn)量大，又可重復(fù)采收，從環(huán)境資源的保護和可持續(xù)利

5、用方面看，開發(fā)利用虎杖葉片中的白黎蘆醇具有很好的前景。 2.采用染色體步移等技術(shù)克隆了虎杖芪合酶基因本試驗得到1567bp長的芪合酶基因片段，利用DNAMAN分析軟件，將其翻譯成氨基酸序列，結(jié)果表明：該片段只編碼芪合酶中的346個氨基酸，包括了活性中心和芪合酶家族特征信號區(qū)。經(jīng)BLAST搜索，對虎杖芪合酶基因序列對比分析表明，它與大黃(Rheumtataricum)的芪合酶mRNA的核苷酸序列相似性最高，達86％。 3.

6、采用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆了羊蹄甲果莢芪合酶cDNA全長羊蹄甲果莢芪合酶cDNA編碼區(qū)全長為1170bp，編碼389個氨基酸，該氨基酸序列含有芪合酶家族特征信號區(qū)GVLFGFGPGLT和活性中心序列GCFAGGTVLR，其中的半胱氨酸(C)在芪合酶活性中心的形成中起核心作用。 將羊蹄甲與其它植物芪合酶編碼區(qū)核苷酸序列與氨基酸序列進行比較，從核苷酸序列的比較看，羊蹄甲芪合酶基因編碼區(qū)序列與豆科植物花生的同源性較高，均在80

7、％以上，最高達82.82％；與葡萄科的葡萄和蓼科的大黃的同源性較低，在60％～65％之間。從氨基酸序列的比較看，羊蹄甲芪合酶氨基酸序列與花生的同源性最高為87.15％。 利用DNAMAN分析軟件，將羊蹄甲芪合酶與已經(jīng)登錄的植物芪合酶的氨基酸序列作多重比對，繪制成進化樹。從進化樹可以看出，植物芪合酶的分類比較簡單，可以聚成3大類，豆科、葡萄科和蓼科植物各聚成一類。羊蹄甲屬豆科植物，與花生在同一類中。 4.建立了以甜瓜子葉塊

8、為外植體的植株遺傳轉(zhuǎn)化再生體系試驗表明，不定芽分化最適培養(yǎng)基為MS+6-BA2.0mg/L+IBA0.5mg/L+3.0％蔗糖，不定芽伸長最適培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+IAA0.1mg/L+3.5％蔗糖。薄皮甜瓜子葉塊外植體對卡那霉素不敏感，不定芽在含有400mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基上還能正常生長。因此卡那霉素不適合作彌河銀瓜遺傳轉(zhuǎn)化的篩選抗生素，潮霉素是合適的篩選抗生素，15mg/L潮霉素是彌河銀瓜篩選轉(zhuǎn)化體與非轉(zhuǎn)化體的臨