SARS-CoV N蛋白免疫原性和致病性的初步研究.pdf

1、嚴(yán)重的急性呼吸道綜合征(severeacuterespiratorysyndrom，SARS)是一種傳染性極強(qiáng)的呼吸系統(tǒng)疾病，2002年11月至2003年7月在我國內(nèi)地和世界上30多個國家和地區(qū)出現(xiàn)流行，引起全世界高度關(guān)注。世界衛(wèi)生組織于2003年4月16日確認(rèn)，引起SARS的病原體是冠狀病毒的一個變種，稱為SARS相關(guān)冠狀病毒(SARS-associatedcoronavirus，SARS-CoV)，其擴(kuò)散范圍之廣，傳播速度之快和對全

2、球經(jīng)濟(jì)影響之嚴(yán)重為近年來發(fā)現(xiàn)傳染病之最，對人們的身體健康和生命安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。為了預(yù)防SARS-CoV的再次出現(xiàn)，研制有效的預(yù)防SARS-CoV感染的疫苗，探討SARS-CoV的致病機(jī)理指導(dǎo)臨床用藥乃當(dāng)務(wù)之急。本研究利用N基因重組的疫苗免疫鼠，通過分析其誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫的能力研究其免疫原性；并且利用N基因重組的腺病毒感染肺上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，探討其在SARS-CoV急性感染中炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生機(jī)制，為認(rèn)識SARS-

3、CoV的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。 第一節(jié)SARS-CoVN基因重組腺病毒載體的構(gòu)建 為了研究N蛋白的免疫原性及致病性，利用PfuDNApolymerase，通過PCR的方法擴(kuò)增到目的基因，首先通過酶促反應(yīng)構(gòu)建N基因重組的轉(zhuǎn)移載體，經(jīng)過測序驗(yàn)證之后，將N基因重組的轉(zhuǎn)移載體與腺病毒表達(dá)載體通過酶促反應(yīng)進(jìn)行同源重組，獲得N基因重組的腺病毒，并對此病毒進(jìn)行PCR和Westernblot鑒定分析。另外，將此重組的腺病毒感染VeroE6細(xì)

4、胞，通過Westernblot鑒定分析N蛋白的表達(dá)。 測序結(jié)果表明，N基因重組的腺病毒轉(zhuǎn)移載體含有全長N基因?yàn)?269bp，與GeneBank中的AY304495株SARS-CoV的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對一致率100﹪。在N基因重組的腺病毒表達(dá)載體質(zhì)粒中以PCR的方法擴(kuò)增到1269bp的DNA片段，N基因重組腺病毒表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293A細(xì)胞獲得重組的腺病毒，然后，將其感染VeroE6細(xì)胞。通過Westernblot分析上述293A細(xì)胞

5、和VeroE6細(xì)胞都有48kDa的N蛋白表達(dá)。這些結(jié)果表明，成功地構(gòu)建了N基因重組的腺病毒。 第二節(jié)SARS-CoVN基因重組DNA疫苗和腺病毒疫苗在BALB/c小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)N蛋白特異的免疫應(yīng)答的初步研究 針對SARS-CoV感染的臨床特點(diǎn)，為了預(yù)防SARS-CoV的再次出現(xiàn)，研制有效的能夠誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的SARS-CoV的基因疫苗是非常必要的。本研究中我們構(gòu)建了N基因重組的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-N和N基

6、因重組的復(fù)制缺陷的腺病毒載體疫苗rAd-N，將這兩種疫苗以不同的組合連續(xù)4次免疫接種BALB/c小鼠來探討哪一種組合能夠誘導(dǎo)最強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。 結(jié)果顯示，對于試驗(yàn)組而言，無論體液免疫還是細(xì)胞免疫的水平都比對照組高；正向免疫組合(先免疫DNA疫苗再以病毒疫苗加強(qiáng))的方案和逆向免疫組合(先以病毒疫苗免疫再以DNA疫苗加強(qiáng))的方案中的異源性載體組合都可以有效地誘導(dǎo)體液免疫，異源性組合誘導(dǎo)的體液免疫與同源性組合相比有明顯的不同。

7、在細(xì)胞免疫的檢測中發(fā)現(xiàn)，對CTL的誘導(dǎo)中重組腺病毒組與異源性組合的免疫原性區(qū)別不大，都能誘導(dǎo)較強(qiáng)的CTL應(yīng)答。對淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)和分泌IFN-γ的檢測發(fā)現(xiàn)，異源性載體免疫組合比同源性載體組合的免疫原性要強(qiáng)得多。結(jié)論，本研究中正向免疫組合的方案比逆向免疫組合的方案免疫效應(yīng)要強(qiáng)；在所有組合中，尤其以免疫組合pcDNA3.1-N/pcDNA3.1-N/pcDNA3.1-N/rAd-N誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答、淋巴細(xì)胞增殖應(yīng)答、IFN-γ的分泌和CTL的

8、應(yīng)答水平比較強(qiáng)，有希望成為SARS-CoV疫苗的候選方案。同時也證明，先以SARS-CoVN基因重組的DNA疫苗免疫再以相同基因重組的腺病毒疫苗來加強(qiáng)免疫的方案能夠誘導(dǎo)增強(qiáng)的小鼠體液和細(xì)胞免疫。 第三節(jié)SARS-CoVN基因重組腺病毒感染對巨噬細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞前炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)和分泌水平的影響為了在蛋白質(zhì)水平上明確SARS-CoV的致病機(jī)理，弄清楚究竟哪一種蛋白質(zhì)誘導(dǎo)了炎性細(xì)胞因子的大量分泌，我們選擇N蛋白作為我們的研究

9、對象，構(gòu)建了SARS-CoV全長的N基因重組的腺病毒，利用N基因重組的腺病毒感染人的單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞和人的肺上皮細(xì)胞A549，通過檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的炎性細(xì)胞因子的分泌水平和相應(yīng)細(xì)胞因子的mRNA的表達(dá)水平，探討N蛋白在SARS-CoV所引起的免疫損傷中所發(fā)揮的作用。 試驗(yàn)結(jié)果表明，巨噬細(xì)胞被重組腺病毒(rAd-N)感染后檢測到IL-1β和IL-8mRNA的表達(dá)，在4h、12h和24h時mRNA的表達(dá)水平是不斷變化的，總趨

10、勢是在24h之內(nèi)逐漸升高，和對照組(rAd-LacZ感染)相比有明顯的差異(P＜0.05)。A549細(xì)胞被重組病毒rAd-N感染后只檢測到IL-8mRNA表達(dá)水平的變化，其變化也是在24h之內(nèi)逐漸升高，與對照組(rAd-LacZ感染)相比也有明顯的差異(P＜0.05)。在4h、8h、16h和24h4個時間點(diǎn)取巨噬細(xì)胞和A549細(xì)胞被重組腺病毒(rAd-N)感染后的培養(yǎng)上清，進(jìn)行ELISA分析，巨噬細(xì)胞所分泌的IL-1β和IL-8在24h

11、之內(nèi)的分泌是逐步升高的，與對照組(rAd-LacZ感染)有明顯的差異(P＜0.05)。重組病毒感染后的A549細(xì)胞對IL-8的分泌在24h之內(nèi)也是逐漸升高，與對照組相比也有明顯差異(P＜0.05)。此結(jié)果證明N蛋白與SARS-CoV感染的急性期巨噬細(xì)胞和肺上皮細(xì)胞分泌大量的前炎癥細(xì)胞因子有關(guān)，值得進(jìn)一步研究。 第四節(jié)樹突狀細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定DC作為體內(nèi)專職的抗原提呈細(xì)胞具有攝取、處理和提呈抗原至T細(xì)胞的功能，是目前公認(rèn)的體內(nèi)抗原提

12、呈功能最強(qiáng)的專職APC。但是，DC在體內(nèi)含量甚微，僅占外周單個核細(xì)胞的0.1﹪～0.5﹪，難以分離和純化。本研究從正常人外周血獲取單核細(xì)胞，經(jīng)體外GM-CSF聯(lián)合IL-4及TNF-α培養(yǎng)，并通過其形態(tài)、表型及刺激活性等來鑒定DC。 結(jié)果顯示，通過GM-CSF聯(lián)合IL-4、TNF-α的培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)出了人外周血單核細(xì)胞來源的DC。形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果證實(shí)，成熟的DC呈懸浮狀，形態(tài)不規(guī)則，表面可見明顯突起，且細(xì)胞體積明顯增大。FACS檢測

13、結(jié)果顯示DC表面高表達(dá)相對特異性的標(biāo)志，分別為CD40(71.91﹪)、CD80(63.40﹪)、CD86(73.39﹪)、MHCⅡ(90.34﹪)。經(jīng)3H-TdR摻入法檢測證明，本法所獲得的DC在體外混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)中能強(qiáng)烈激發(fā)臍帶血中原始T淋巴細(xì)胞的增殖，證實(shí)DC是成熟的。 第五節(jié)SARS-CoVN基因重組腺病毒感染對樹突狀細(xì)胞前炎癥細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平和分泌水平的影響 為了在蛋白質(zhì)水平上探討SARS-CoV的致

14、病機(jī)理，本研究在建立DC培養(yǎng)方法的前提下，利用SARS-CoV的N基因重組腺病毒(rAd-N)來感染未成熟和成熟的DC，探討前炎癥細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)和分泌水平的動態(tài)變化。 結(jié)果證明，用RT-PCR的方法在不同時間檢測到rAd-N感染的DC對IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)有明顯的變化，分別在4h、12h和24h收集被重組腺病毒(rAd-N)感染后的未成熟DC，通過RT-PCR檢測mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL-6和TNF-αmRN

15、A的表達(dá)水平前24h之內(nèi)是逐漸升高的，和對照組(rAd-LacZ感染)相比有明顯的差異(p＜0.05)。成熟DC被重組病毒(rAd-N)感染后也檢測到IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)水平的變化，其變化也是在24h之內(nèi)逐漸升高，與對照組(rAd-LacZ感染)相比也有明顯的差異。這兩組細(xì)胞相比，未成熟DC對兩種炎癥因子的表達(dá)都比成熟的DC要高。同時ELISA檢測的結(jié)果與RT-PCR的檢測基本一致：在4h、8h、16h和24h4個時間點(diǎn)取

16、未成熟和成熟DC被重組的腺病毒(rAd-N、rAd-LacZ)感染后的培養(yǎng)上清，進(jìn)行ELISA分析，在培養(yǎng)上清中只檢測到IL-6和TNF-α，未檢測到IL-1β和IL-8的分泌。未成熟DC分泌的IL-6和TNF-α在24h之內(nèi)也是逐漸升高，與對照組相比有明顯的差異(p＜0.05)。病毒感染后的成熟DC在24h對IL-6和TNF-α的分泌也是逐漸升高的，與對照組相比也有明顯差異(p＜0.05)。本研究反應(yīng)了N蛋白與SARS的急性期DC分泌