甘薯淀粉酶組織特異性及基因克隆和表達(dá).pdf

1、通過(guò)液氮研磨提取甘薯愈傷組織和塊根可溶性提取物，并采用非變性凝膠電泳和淀粉酶活性染色方法的研究發(fā)現(xiàn)，甘薯愈傷組織有4種遷移率不同的淀粉酶活性帶，而塊根只有1條淀粉酶活性帶。以特異性底物支鏈淀粉對(duì)4種遷移率不同的淀粉酶進(jìn)行類(lèi)型鑒定，愈傷組織有2種α-淀粉酶和2種β-淀粉酶，而塊根只有一種β-淀粉酶。淀粉酶抑制劑EDTA和β-巰基乙醇的敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，塊根β-淀粉酶對(duì)2種抑制劑都不敏感，而愈傷組織的淀粉酶則對(duì)2種抑制劑都敏感。 甘

2、薯愈傷組織誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基組成成分都可能對(duì)淀粉酶基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。不同激素對(duì)甘薯愈傷組織淀粉酶基因的表達(dá)都有重要作用，蔗糖的作用尤為重要。對(duì)甘薯愈傷組織進(jìn)行不同時(shí)間的高溫、低溫、水澇、高溫．水澇和低溫。水澇處理后，對(duì)其可溶性提取物做非變性凝膠電泳和活性染色，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)愈傷組織中3種主要淀粉酶基因的表達(dá)均具有不同程度的影響。在高溫下的3種主要淀粉酶在前24h左右變化幅度相對(duì)較大，而低溫對(duì)愈傷組織中的淀粉酶基因表達(dá)有增強(qiáng)作用，其中對(duì)β-淀

3、粉酶基因B1的影響最為明顯。甘薯愈傷組織高溫-水澇總體上使3種淀粉酶活性呈下降趨勢(shì)，其中淀粉酶A2和B1變化幅度相對(duì)較大。低溫一水澇對(duì)3種淀粉酶活性的影響與高溫-水澇的情況相似。 利用PCR技術(shù)從甘薯新大紫(lpomoea batatas Lam cv．Xindazi)基因組中擴(kuò)增出預(yù)期大小的β-淀粉酶基因DNA片段(約3kb)。將該片段克隆至pMD-T載體，經(jīng)酶切分析和序列測(cè)定顯示，該片段長(zhǎng)2914bp，限制酶BamHI，Bg

4、lⅡ,EcoRV,Sad,SalI,XbaI,XhoI在片段中各有1個(gè)酶切位點(diǎn)，EcoRI有3個(gè)酶切位點(diǎn)，無(wú)HindⅢ，KpnI酶切位點(diǎn)。對(duì)克隆的β-淀粉酶基因進(jìn)行序列分析然后與甘署另一晶種(lpomoea batatas Lam CV．Kokei No．14)的核苷酸相比，有99.1％的序列相同，但新大紫的β-淀粉酶基因共有8處堿基變異，集中在第Ⅵ外顯子中。 堿基變異共造成5個(gè)氨基酸變化。甘薯新大紫β-淀粉酶與Kokei No

5、.14甘薯β-淀粉酶的氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，兩者具有高達(dá)99.0％的同源性。 利用RT-PCR技術(shù)從甘薯新大紫(Ipomoea batatas Lam cv．Xindazi)塊根總RNA中擴(kuò)增出預(yù)期大小的β-淀粉酶cDNA片段(約1.5 kb)。然后將其插入pmDl8-T載體中，獲得具有正確插入方向的重組質(zhì)粒被命名為pMD-cAmy序列測(cè)定結(jié)果顯示，該片段長(zhǎng)1521bp，其開(kāi)放閱讀框(ORF)編碼499個(gè)氨基酸殘基，預(yù)

6、測(cè)分子量55.97 kDa?？寺〉摩?淀粉酶cDNA與報(bào)道的甘薯另一品種KokeiNo.14的mRNA有99.5％的序列相同。重組子經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，胞內(nèi)可溶性提取物經(jīng)凝膠電泳和活性染色，出現(xiàn)明顯的淀粉酶活性帶。重組子pMD-cAmy’在淀粉平板上形成明顯的水解圈，說(shuō)明甘薯β-淀粉酶cDNA不僅能在大腸桿菌中表達(dá)，而且能將有活性的β-淀粉酶分泌到胞外。對(duì)重組子pMD-cAmy和甘薯塊根可溶性提取物的比較研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌表達(dá)的β-淀粉酶