CXCR4內(nèi)毒素急性肺損傷作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分內(nèi)毒素急性肺損傷大鼠肺組織CXCR4的表達(dá)及其作用 [目的] 通過檢測(cè)內(nèi)毒素急性肺損傷(acutelunginjuryALI)時(shí)肺組織CXCR4的表達(dá)，研究其與炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)以及肺損傷病理指標(biāo)變化之間的關(guān)系，探討其在內(nèi)毒素引起ALI過程中的作用。 [方法] 將SD大鼠分為5組：①對(duì)照組、②2h組、③4h組、④8h組、⑤12h組。尾靜脈注射LPS，復(fù)制ALI模型。在LPS注射后2、4、8、12小

2、時(shí)分別用免疫組化、WesternBlot及RT-PCR法檢測(cè)CXCR4、SDF-1α、TNF-α、IL-1β及IL-18在大鼠肺組織中的表達(dá)。 [結(jié)果] SD大鼠肺組織中存在有CXCR4及SDF-1α的表達(dá)。LPS導(dǎo)致ALI時(shí)，CXCR4及SDF-1α蛋白和mRNA表達(dá)明顯升高(P＜0.05)，且與TNF-α、IL-1β及IL-18的表達(dá)具有相同的變化趨勢(shì)。 [結(jié)論] LPS能促進(jìn)大鼠肺組織CXCR4及S

3、DF-1α的表達(dá)，進(jìn)而引起大量炎癥細(xì)胞因子的釋放，造成肺組織損害。CXCR4及SDF-1α可能在LPS引起ALI過程中發(fā)揮重要作用。 第二部分LPS作用下大鼠肺泡巨噬細(xì)胞CXCR4的表達(dá)及作用 [目的] 研究LPS作用下體外培養(yǎng)的肺泡巨噬細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)變化與細(xì)胞因子表達(dá)間的關(guān)系，并通過應(yīng)用CXCR4阻斷劑AMD3100干預(yù)LPS對(duì)巨噬細(xì)胞的作用，檢測(cè)CXCR4與細(xì)胞因子的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討CXCR4在L

4、PS激活炎癥細(xì)胞因子過程中的作用。 [方法] 將分離培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞隨機(jī)分組： (1)單獨(dú)應(yīng)用LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞。 (2)用AMD3100預(yù)處理肺泡巨噬細(xì)胞30min后，再以LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞。 (3)同時(shí)應(yīng)用AMD3100和LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞。 (4)LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞30min后，再用AMD3100作用于肺泡巨噬細(xì)胞。 在LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，分別應(yīng)用

5、ELISA、WesternBlot及RT-PCR法檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6濃度以及肺泡巨噬細(xì)胞CXCR4蛋白和mRNA表達(dá)的變化。 [結(jié)果] LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞后不同時(shí)間CXCR4蛋白和mRNA表達(dá)以及肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的濃度與正常對(duì)照組相比均明顯增加(P＜0.05)。 AMD3100預(yù)處理、AMD3100與LPS同時(shí)應(yīng)用及AMD3100遲后于LPS應(yīng)用時(shí)，在LPS作

6、用下，CXCR4蛋白和mRNA均較正常對(duì)照組明顯增加(P＜0.05)，與單獨(dú)應(yīng)用LPS時(shí)相比，CXCR4蛋白和mRNA在各時(shí)點(diǎn)的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。 AMD3100預(yù)處理與正常對(duì)照組相比，肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的濃度均稍增加，差異無顯著性(P＞0.05)；與單獨(dú)應(yīng)用LPS刺激時(shí)相比，培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的濃度降低，差異有顯著性(P＜0.05)。AMD3100預(yù)處理同與LPS同時(shí)應(yīng)用相比，培

7、養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的濃度稍低，差異有顯著性(P＜0.05)。 AMD3100遲后于LPS應(yīng)用時(shí)，與正常對(duì)照組相比，肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的濃度均較正常對(duì)照組增加，差異有顯著性(P＜0.05)，與單獨(dú)應(yīng)用LPS刺激時(shí)相比，肺泡巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中TNF-α和IL-6的濃度降低，但差異無顯著性(P＞0.05)。 [結(jié)論] LPS能夠刺激肺泡巨噬細(xì)胞CXCR4的表達(dá)，進(jìn)而產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子。AM

8、D3100阻斷CXCR4后，能夠抑制LPS引起的炎癥細(xì)胞因子釋放，表明CXCR4可能在LPS的受體識(shí)別及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮作用。 第三部分CXCR4在內(nèi)毒素耐受性中的作用機(jī)制 [目的] 通過檢測(cè)LPS預(yù)處理后LPS作用下肺組織和體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)，研究CXCR4與炎癥細(xì)胞因子表達(dá)之間的關(guān)系以及LPS預(yù)處理對(duì)內(nèi)毒素急性肺損傷的影響，更進(jìn)一步探討CXCR4在內(nèi)毒素引起ALI過程中的作用。 [

9、方法] (一)CXCR4在LPS預(yù)處理肺組織的表達(dá) 將SD大鼠隨機(jī)分組： (1)LPS組以5mg/kg尾靜脈注射LPS，復(fù)制ALI模型。 (2)LPS預(yù)處理組首次經(jīng)腹腔注射LPS(0.25mg/kg)，24小時(shí)后再經(jīng)腹腔注射LPS(0.5mg/kg)，第2次腹腔注射72小時(shí)后，經(jīng)尾靜脈注射LPS(5mg/kg)。 尾靜脈注射LPS后2、4、8、12小時(shí)分別用免疫組化、WesternBlot及RT-

10、PCR法檢測(cè)CXCR4、TNF-α、IL-1β及IL-18在大鼠肺組織中的表達(dá)。 (二)CXCR4在LPS預(yù)處理肺泡巨噬細(xì)胞的表達(dá) 將培養(yǎng)好的肺泡巨噬細(xì)胞隨機(jī)分組： (1)LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞后4小時(shí)，檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β及IL-18)和CXCR4表達(dá)的變化。 (2)LPS預(yù)先刺激培養(yǎng)12小時(shí)，再用LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞4小時(shí)后，檢測(cè)肺泡巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1