保幼激素調(diào)控家蠶壽命的分子機(jī)制研究.pdf

1、壽命是指生物體從出生經(jīng)過(guò)生長(zhǎng)、發(fā)育、成熟、衰老以至死亡前生存的時(shí)間，通常以年齡作為衡量尺度。目前，關(guān)于壽命，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)在不同物種（酵母、線蟲(chóng)、果蠅、蜜蜂、小鼠和非人靈長(zhǎng)類甚至人類等）和不同水平（群體、個(gè)體、細(xì)胞和分子等）上進(jìn)行了較為廣泛而深入的研究。雖然目前的研究已經(jīng)取得了眾多重大的突破和較大的進(jìn)展，但仍有很多局限。因此，研究者們需要新的用于壽命研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，以便從更廣的角度揭示壽命調(diào)控的分子機(jī)制。家蠶不僅是鱗翅目昆蟲(chóng)的代表，還是一種

2、模式昆蟲(chóng)，具有品系眾多、遺傳背景清晰、個(gè)體大小適中便于實(shí)驗(yàn)操作和具備較為完善的研究基礎(chǔ)及平臺(tái)等。家蠶用于壽命研究尚鮮有報(bào)道，但是，基于上述優(yōu)點(diǎn)，家蠶具有被用作一種新的壽命研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的潛能。壽命是一個(gè)較為復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象或性狀，決定和影響因素眾多。經(jīng)過(guò)多年的研究，目前對(duì)于其影響因素和調(diào)控機(jī)制的研究有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，包括胰島素信號(hào)通路等許多調(diào)控通路的發(fā)現(xiàn)等。在調(diào)控壽命的眾多因素中，內(nèi)分泌是其中尤為重要的一種。據(jù)報(bào)道，在高等動(dòng)物中，性激素（

3、如睪酮和雌激素）、脫氫表雄酮（DHEA）、生長(zhǎng)激素和胰島素等均能調(diào)控壽命。而在昆蟲(chóng)中，最重要的兩種激素分別是保幼激素（juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（20-hydroxyecdysone，20E）。目前，國(guó)內(nèi)外研究者關(guān)于保幼激素的研究主要集中在其對(duì)昆蟲(chóng)生長(zhǎng)、發(fā)育、變態(tài)和生殖等生命過(guò)程的調(diào)控，而本研究則旨在探究保幼激素對(duì)家蠶壽命的調(diào)控。獲得的主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　　1.保幼激素含量對(duì)家蠶壽命的影響
　

4、　前人的大量研究表明，用保幼激素類似物處理家蠶幼蟲(chóng)，能夠顯著延長(zhǎng)幼蟲(chóng)的齡期經(jīng)過(guò)。但關(guān)于JH對(duì)家蠶蛾期的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，我們通過(guò)給新羽化蠶蛾注射保幼激素III（juvenile hormone III，JH III）或其類似物甲氧普林（methoprene）發(fā)現(xiàn)，雄蛾的壽命均顯著縮短，而對(duì)雌蛾壽命無(wú)顯著影響。通過(guò)給新羽化蠶蛾注射抑咽側(cè)體素（allatostatin）以減少家蠶體內(nèi)保幼激素的含量，則能顯著延長(zhǎng)雄蛾的壽命。通過(guò)這組正

5、反實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，增加蠶蛾體內(nèi)保幼激素的含量可以縮短雄蛾壽命；而減少之則能顯著延長(zhǎng)雄蛾的壽命。
　　2.家蠶保幼激素結(jié)合蛋白基因家族的分析和BmTO基因的鑒定
　　通過(guò)生物信息學(xué)分析，我們分析了家蠶中保幼激素結(jié)合蛋白基因家族，并發(fā)現(xiàn)，家蠶中存在30個(gè)含有保幼激素結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)域（JHBP）的基因。通過(guò)對(duì)家蠶、果蠅、岡比亞按蚊和意蜂中含有JHBP結(jié)構(gòu)域的基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析發(fā)現(xiàn)，所有基因可聚成A-J共10個(gè)進(jìn)化枝。其中，同一物種

6、內(nèi)的大部分基因可以單獨(dú)聚成一支，而其他不同物種的直系同源基因可以聚在一起。染色體定位結(jié)果顯示，家蠶中的大部分基因成串分布于第15號(hào)染色體和23號(hào)染色體，而其他基因則單獨(dú)分布于某一條染色體上。家蠶幼蟲(chóng)五齡三天基因的組織表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，絕大部分基因均在頭、體壁、中腸、馬氏管和生殖腺中呈現(xiàn)高表達(dá)。同時(shí)，經(jīng)同源序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，家蠶中的BGIBMGA003345基因與果蠅takeout基因的同源性最高，因此我們推測(cè)該基因即是takeout基因的直

7、系同源基因。因此，我們將其命名為BmTO基因。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)BmTO基因位于家蠶第15號(hào)染色體，并在頭和生殖腺（精巢和卵巢）中高表達(dá)。
　　3.保幼激素對(duì)BmFoxO基因表達(dá)量的影響
　　FoxO基因是調(diào)控壽命的關(guān)鍵基因，多條壽命調(diào)控的信號(hào)通路均匯聚于此。本研究中，我們通過(guò)運(yùn)用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)JH III處理雄蛾后BmFoxO基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，雄蛾被處理24 h后，該基因的表達(dá)量顯著降低。此外，分別用5μM、10μM

8、和20μM的JH III處理家蠶卵巢細(xì)胞系BmNS6 h、12 h和24 h后，檢測(cè)BmFoxO基因的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，6 h后尚無(wú)變化，而12 h后，BmFoxO基因的表達(dá)量顯著降低，24 h后，BmFoxO基因的表達(dá)量又恢復(fù)到了正常水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明了用JH III處理BmNS細(xì)胞后會(huì)抑制BmFoxO基因的表達(dá)。同時(shí)也說(shuō)明了BmNS細(xì)胞對(duì)JH III處理的響應(yīng)具有一定的時(shí)間和劑量依賴性。
　　4. BmTO基因的功能研究
　　

9、果蠅中takeout基因具有調(diào)控?cái)z食行為、響應(yīng)生理節(jié)律、響應(yīng)饑餓和調(diào)控求偶行為等功能，同時(shí)，該基因也是眾多壽命調(diào)控信號(hào)通路的匯聚點(diǎn)。本研究中，我們通過(guò)生物信息學(xué)分析，克隆鑒定了家蠶中的BmTO基因，并發(fā)現(xiàn)該基因不僅能響應(yīng)饑餓，還具有結(jié)合保幼激素的功能。通過(guò)在家蠶卵巢細(xì)胞系BmNS中過(guò)表達(dá)和干涉BmFoxO基因，并進(jìn)行定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BmTO基因的表達(dá)量也隨之上調(diào)或下調(diào)。而且，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，BmTO基因的上游調(diào)控區(qū)存在BmFoxO的

10、結(jié)合位點(diǎn)。因此，我們推測(cè)BmTO基因是BmFoxO基因的下游直接靶基因，即BmFoxO可直接結(jié)合在BmTO基因上游調(diào)控區(qū)從而促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)保幼激素能縮短蠶蛾的壽命，并初步揭示了其調(diào)控機(jī)制。結(jié)合前人研究，我們推測(cè)JH通過(guò)與其受體Met結(jié)合，再與Tai等其他蛋白結(jié)合，形成一種復(fù)合物，然后結(jié)合到BmFoxO基因上游調(diào)控區(qū)的JH應(yīng)答元件，從而抑制BmFoxO基因的表達(dá)，接著降低BmFoxO基因的靶基因BmTO基因的