CTE-RHA復合核酶的構建及抑制HCV RNA復制和相應蛋白表達的研究.pdf

1、目的:構建實驗所需的真核表達載體，特別是人源性tRNA val啟動子驅動CTE介導的核酶高效表達載體pPHCV5-CR以及對應的無CTE介導的載體pPHCV5．R；建立HCV Subgenomie Replieon穩(wěn)定轉染和表達的細胞株；探討核酶和核酶．CTE復合物對丙型肝炎病毒亞基因組的影響，進一步探討丙型肝炎治療研究方向。 研究方法: 1、構建相應的核酶載體合成CTE-DNA，設計、構建含tRNAval啟動子的核酶和

2、帶有CTE的含tRNAval啟動子的核酶。 2、建立HCV Subgenomic Replieon穩(wěn)定轉染和表達的細胞株在脂質體lipofectamine<'TM>2000介導下，將含有HCV Subgenes的真核表達質粒pHCV BM4-5導入人肝癌細胞系QSR7701中，經G418篩選抗性克隆，擴大培養(yǎng)，建立轉染克隆細胞系。用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)和蛋白印跡法證實轉染成功及其蛋白表達。 3、觀察四種質粒

3、pPHCV5-R1、pPHCV5-R2、pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2對HCV Subgenomic Replicon穩(wěn)定轉染和表達的細胞株中HCV RNA和相應病毒蛋白表達的影響。 結果: 1、經測序后證實，成功構建相應的核酶載體，為下一步實驗奠定基礎。 2、經RT-PCR和Western Blot證實，成功建立穩(wěn)定轉染HCVSubgenomic Replicon和表達的細胞株。 3、用構建的普通核

4、酶pPHCV5-R1、pPHCV5-R2和復合核酶pPHCV5-CR1、pPHCV5-CR2瞬時轉染含HCV亞基因復制子的穩(wěn)定轉染QSG7701細胞株，48小時后收集細胞進行RT-PCR和WesternBlot，RT-PCR(以β-actin為內對照)結果顯示：pPHCV5．CRl轉染組未見明顯擴增目的條帶，pPHCV5-R1轉染組可見擴增目的條帶，亮度低于未轉染組和空質粒轉染組；pPHCV5-CR2轉染組可見擴增目的條帶，亮度低于未轉

5、染組和空質粒轉染組，pPHCV5-R2轉染組可見擴增目的條帶，亮度與未轉染組和空質粒轉染組接近。這些提示：復合核酶(帶有CTE)在細胞內的切割靶RNA的效率明顯高于普通核酶。普通核酶難以切割的位點，復合核酶能進行有效的切割；普通核酶能進行切割的位點，帶CTE-核酶的切割效率明顯提高。WesternBlot(以β-actin為內對照)結果顯示：應用軟件分析各組細胞目的蛋白表達量無明顯差異，可能與瞬時轉染作用時間短、蛋白表達變化不明顯，也可