鉛誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究.pdf

1、目的： 探討鉛是否誘導(dǎo)人腎近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2)凋亡，并進(jìn)一步研究鉛誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的途徑，為預(yù)防和治療鉛性腎病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)。 方法： 以不同濃度的鉛(0、50、100、200、400μmol/L)與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)48h作量效分析；以400μmol/L鉛與HK-2細(xì)胞共培養(yǎng)(0、12、24、48h)作時(shí)效分析；平板克隆實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)細(xì)胞活力；Hochest33258熒光染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改

2、變；Annexin—V(FITC)/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率；熒光化學(xué)分光儀分析caspase—3、—8、—9(半胱天冬酶—3、—8、—9)的活性變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)細(xì)胞色素c(Cytc)的釋放；Westernbolt檢測(cè)caspase—3、—9、bcl-2、bax蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 結(jié)果： 1．平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：鉛可抑制HK-2細(xì)胞生長(zhǎng)活力，隨著鉛濃度的增高及

3、染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)活力越低(p＜0.05，p＜0.01)； 2．Hochest33258熒光染色觀察到鉛使HK-2細(xì)胞胞體縮小、胞漿濃縮、核染色質(zhì)聚集、核固縮、核碎裂等典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變； 3．鉛呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。50、100、200、400μmol/L鉛染毒48h后，凋亡率分別為4.35％±1.08％、13.39％±0.53％、18.09％±2.54％、30.85％±0.93％，400μmo

4、l/L染毒12、24、48h后，凋亡率分別為5.36％±1.38％、14.38％±1.05％、31.08％±1.94％(p＜0.05，p＜0.01)； 4．流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示．鉛誘導(dǎo)Cytc從線粒體釋放入胞漿，釋放量呈劑量依賴性和時(shí)間依賴性增高(p＜0.05，p＜0.01)； 5．鉛使caspase—3、caspase—9的活性增強(qiáng)(p＜0.05，p＜0.01)，但對(duì)caspase—8的活性無明顯影響； 6．ca

5、spase—3抑制劑可明顯抑制鉛誘導(dǎo)的caspase—3的活化，并抑制鉛誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞凋亡； 7．Westernbolt結(jié)果顯示，鉛使caspase—3、caspase—9表達(dá)增高，bcl-2蛋白表達(dá)降低，bax蛋白表達(dá)增高。 結(jié)論：1．一定劑量范圍內(nèi)，鉛可導(dǎo)致HK-2細(xì)胞損傷；2．鉛誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡；3．鉛誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制是鉛損壞HK-2細(xì)胞線粒體膜，導(dǎo)致CytC的釋放，激活caspase—9，再