中國(guó)H3N2亞型流感病毒血凝素基因分子變異研究.pdf

1、本文對(duì)我國(guó)保存的H3N2亞型流感毒株進(jìn)行系統(tǒng)的序列測(cè)定和分析。以闡明我國(guó)H3N2亞型流感HA1基因變異特征，比較中國(guó)流行毒株與WHO每年推薦疫苗株的相關(guān)性。 首先，整理國(guó)家流感中心歷年來(lái)保留的毒種和相應(yīng)的毒株背景信息記錄，建立毒株數(shù)據(jù)庫(kù)。為了全面代表中國(guó)流行毒株特征，按以下原則選取毒株，每年按照毒株分離的省區(qū)不同，選取不同分離月份的毒株進(jìn)行測(cè)序。有些年代毒株數(shù)量少于10個(gè)，全部測(cè)序。毒株依據(jù)原傳代史用雞胚或細(xì)胞復(fù)蘇。提取核酸后用

2、RT-PCR方法擴(kuò)增HA1基因片段。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定。采用clastalX進(jìn)行序列的多重比對(duì)，使用Bioedit進(jìn)行序列的差異分析，使用MEGAversion 3.1 軟件繪制基因種系發(fā)生樹(shù)，并進(jìn)行核苷酸和氨基酸的變異速率和距離分析。將我國(guó)每年的H3N2序列代表株與WHO推薦的疫苗株進(jìn)行序列比較分析。 共整理1956～2005年的國(guó)家流感中心保存的流感病毒11232株，其中H3N2亞型病毒5537株，按選取原則，選取H3

3、N2病毒進(jìn)行HA1基因擴(kuò)增，成功測(cè)序732株。 分析結(jié)果如下： 1．從中國(guó)歷年病毒與1968年病毒的距離可以看出，H3N2亞型流感病毒在中國(guó)各地區(qū)的進(jìn)化是按時(shí)間先后進(jìn)行的。H3N2流行的高峰期全國(guó)各地區(qū)的序列一致性較強(qiáng)。在H3N2流行的間期病毒序列間差異較大。 2．H3N2亞型流感病毒HAl區(qū)核苷酸和氨基酸的進(jìn)化樹(shù)均呈典型的階梯形，以單一主干向上發(fā)展，樹(shù)的側(cè)枝很短，主干很長(zhǎng)，顯示出新舊毒株的更替很快。HA1的核苷

4、酸進(jìn)化樹(shù)與氨基酸進(jìn)化樹(shù)相比有更多的分支，氨基酸樹(shù)比核苷酸樹(shù)分支分組更為明顯。 3．中國(guó)1989～1990年、1992～1993年和1998～1999年的流行期北方分離的病毒比南方分離病毒更遠(yuǎn)，推測(cè)這三次H3N2流行是從中國(guó)南方傳到北方。而1995～1996年和2000～2004年沒(méi)有明顯的南北方距離差異。 4．中國(guó)1968～1990年間測(cè)序毒株HA1序列結(jié)合NCBI下載的HA1序列，通過(guò)與1968年病毒距離得出變異速率，

5、結(jié)果表明1968～1978年病毒HA的變異速率高于1979～1990年。通過(guò)與1980年病毒的距離，算出中國(guó)1980～2005年間H3N2亞型流感病毒的HAl區(qū)的核苷酸變異速率為4.7×10<'-3>substitutions/year，推導(dǎo)的氨基酸的變異速率為6.1×10<'-3> replacements/year。 5．高變的位點(diǎn)和穩(wěn)定變化的位點(diǎn)多是已知的抗原位點(diǎn)及其附近的位點(diǎn)。受體結(jié)合位點(diǎn)在1992年后變異的速率比199

6、2年前更快，尤其是220環(huán)區(qū)及附近。HA1區(qū)1968年有6個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，其中5個(gè)維持不變，到1999年逐漸增加到11個(gè)后到2005年沒(méi)有改變，其改變與流行相關(guān)。H3N2亞型流感病毒HA1的氨基酸位點(diǎn)每年變異的幅度不同，有的年位點(diǎn)多，有的年少。 6．通過(guò)HA1序列資料分析發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致H3N2流行的三種方式，第一種是同時(shí)出現(xiàn)多位點(diǎn)變化，第二種是位點(diǎn)變化逐漸發(fā)生累積到多個(gè)位點(diǎn)變化，第三種是單個(gè)抗原位點(diǎn)和受體結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)改變。

7、7．從HA1序列上看中國(guó)流行H3N2亞型毒株與WHO推薦的多株疫苗不匹配，疫苗株處于滯后狀態(tài)。 本研究分析整理并測(cè)定了1968-2005年間H3N2流感病毒732株，通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)HA1序列是按時(shí)間進(jìn)化的，H3N2病毒在流行的前10年變異的速度較快。通過(guò)對(duì)變異位點(diǎn)的分析，發(fā)現(xiàn)抗原位點(diǎn)的不斷變化，受體結(jié)合位點(diǎn)的變異和潛在糖基化位點(diǎn)的改變共同促進(jìn)HA的進(jìn)化，引起H3N2亞型流感的新流行。同時(shí)出現(xiàn)多位點(diǎn)變化，逐漸發(fā)生累積到多個(gè)位點(diǎn)變