水稻黃單胞菌gacA、ppsA和zur基因的克隆及功能分析.pdf

1、水稻黃單胞菌包含兩個(gè)致病變種Xanthomonas orzae pv.oryzae(Xoo)和X.oryzae pv.oryzicola(Xooc)，在水稻上分別引起白葉枯病和細(xì)菌性條斑病。本研究對(duì)水稻黃單胞菌gacA、ppsA和zur基因進(jìn)行克隆與鑒定，并對(duì)基因進(jìn)行序列分析。用同源重組的方式構(gòu)建相應(yīng)基因的插入突變株，通過(guò)與野生型菌株進(jìn)行表型比較來(lái)推知基因相應(yīng)功能。 (一)根據(jù)已公布基因組的X.axonopodis pV.ci

2、trf(Xac)和X.campestris pv.campestris(Xcc)的gacA基因序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物GF/GR，采用PCR的方式從Xoo菌株P(guān)XO99和Xooc菌株RsGD42染色體中擴(kuò)增了gacA基因的同源片斷。核酸序列分析表明，gacA基因全長(zhǎng)648bp，編碼215個(gè)氨基酸的蛋白。Xoo和Xooc gacA基因只有2個(gè)堿基的差別。在與其它種gacA基因比較發(fā)現(xiàn)其在Xanthomonas屬中是保守的。NCBI網(wǎng)站蛋白保守域

3、搜索結(jié)果表明，GacA屬于LuxR蛋白家族相似蛋白的一員。其具有一個(gè)CheB結(jié)構(gòu)功能域，可能參與調(diào)控細(xì)菌的趨化性。 以引物XOR1/XOR2擴(kuò)增gacA基因的內(nèi)部片斷，連接于PMD18-T，獲得重組質(zhì)粒pXOR和pXORs，電擊轉(zhuǎn)化質(zhì)粒于野生型菌株電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞中。通過(guò)單交叉同源重組的方式將重組質(zhì)粒整合入基因組染色體中獲得突變株。PCR和Southern雜交驗(yàn)證質(zhì)粒插入的正確性。通過(guò)對(duì)0.1％Tryptone趨化性的調(diào)控來(lái)看，突變株

4、較野生型的趨化性有了一定程度的下降。但對(duì)其它一些表型的測(cè)定結(jié)果證明，gacA基因并不是水稻黃單胞菌的全局性調(diào)控子。 (二)水稻白葉枯病菌基因組全序列已公布。通過(guò)基因組注釋發(fā)現(xiàn)，Xoo只有一條糖異生路徑，也就是蘋(píng)果酸酶－磷酸烯醇式丙酮酸合成酶途徑。本研究通過(guò)單交換同源重組的方式構(gòu)建了磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因(ppsA)的非極性突變體OSPAM。碳源利用檢測(cè)顯示，野生型菌株P(guān)XO99和互補(bǔ)菌株COSPAM能夠在以檸檬酸、蘋(píng)果酸、

5、琥珀酸、延胡索酸、丙酮酸、甘油或乙酸作為唯一碳源的基本培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而OSPAM。則不能正常生長(zhǎng)。說(shuō)明PPSA途徑是PXO99在糖異生過(guò)程中從四碳二羧酸合成磷酸烯醇式丙酮酸的唯一途徑，這一結(jié)果和基因組注釋相符。利用剪葉接種法接種感病寄主汕優(yōu)63，突變體產(chǎn)生的病斑長(zhǎng)度明顯低于野生型。寄主葉內(nèi)生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果顯示OSPAM的生長(zhǎng)比PXO99低一個(gè)數(shù)量級(jí)。這些結(jié)果表明糖異生過(guò)程是白葉枯病菌致病及在寄主體內(nèi)生長(zhǎng)必需的。 (三)鋅吸

6、收調(diào)控蛋白(Zur)存在于許多細(xì)菌中，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的鋅離子濃度過(guò)高 時(shí)抑制高親和性鋅吸收系統(tǒng)的表達(dá)，避免過(guò)量的鋅對(duì)細(xì)菌產(chǎn)生毒性。在已公布Xoo基因組中沒(méi)有注釋zur基因，用大腸桿菌Zur蛋白序列比對(duì)Xoo KACC10331基因組，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為X001505的ORF編碼的蛋白與大腸桿菌的Zur蛋白有41％的同源性。用PCR的方法從XooPX099中克隆了zur同源基因zur<,Xoo>通過(guò)整合突變法構(gòu)建zur<,Xoo>突變株OSZR