雞FOXL2基因慢病毒載體的構(gòu)建和功能研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物FOXL2（forkhead transcription factor gene2）在卵巢分化和卵巢功能維持上具有重要的作用。FOXL2是雞卵巢分化的重要候選基因，但目前其功能還不清楚。為了探討FOXL2在雞性腺分化過(guò)程中的功能，本研究通過(guò)構(gòu)建FOXL2慢病毒過(guò)表達(dá)載體并在DF1細(xì)胞系驗(yàn)證其功能;通過(guò)胚盤(pán)下腔注射雞胚，探討FOXL2對(duì)雞胚性腺分化的影響;通過(guò)睪丸注射，探討FOXL2對(duì)成年雞性腺功能維持的影響。本研究得出如下結(jié)果:

2、
　　(1)成功克隆了廣西麻雞FOXL2基因CDS全長(zhǎng)序列，共918bp，將測(cè)序結(jié)果與GenBank上雞參考序列(NM_001012612.1)相比，同源性99.7％，存在三處堿基突變，分別是T226C，C501T和T690C。物種間同源性比較結(jié)果顯示，廣西麻雞FOXL2基因CDS區(qū)序列與豬，鼠和人的同源性分別為80.5％，80.3％和80.1％。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，廣西麻雞與人的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與鼠的親緣關(guān)系最近。
　　(2)用

3、BamHⅠ和EcoRⅠ同時(shí)雙酶切pMD-FOXL2克隆質(zhì)粒和pLV慢病毒空質(zhì)粒，然后連接轉(zhuǎn)化到Trans5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)菌液PCR、雙酶切和測(cè)序鑒定，成功獲得了pLV-FOXL2慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將pLV-FOXL2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入雞DF1細(xì)胞系，在倒置熒光顯微鏡下，觀察到轉(zhuǎn)染pLV-FOXL2重組質(zhì)粒后，DF1能檢測(cè)到綠色熒光蛋白的表達(dá)，說(shuō)明構(gòu)建的pLV-FOXL2慢病毒過(guò)表達(dá)質(zhì)粒具有表達(dá)活性。QRT-PCR檢測(cè)其F

4、OXL2的過(guò)表達(dá)效率，結(jié)果表明FOXL2的過(guò)表達(dá)效率與對(duì)照差異極顯著。
　　(3)將pLV-FOXL2質(zhì)粒和pLV空質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，制作質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物，通過(guò)胚盤(pán)下腔注射法將復(fù)合物注入孵化到第2天的雞胚，孵化到16.5天，在體視顯微鏡下觀察性腺的表型變化，收集性腺組織用作后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量(qPCR)，組織切片和免疫組化分析，采集肌肉組織分別用于遺傳性別鑒定和陽(yáng)性個(gè)體鑒定。結(jié)果顯示，pLV-FOXL2組共注射260枚，存活41

5、枚，存活率為15.8％，其中遺傳性別為公的23只，遺傳性別為母的18只，表型性別為公的21只，表型性別為母的18只，其中有2只的表型性別不典型，左側(cè)性腺膨大變黃類(lèi)似卵巢結(jié)構(gòu)。pLV組共注射100枚，存活21枚，存活率為21.0％，遺傳性別為公的9只，遺傳性別為母的12只，表型性別與遺傳性別一致。陽(yáng)性個(gè)體鑒定結(jié)果示顯，pLV-FOXL2組有10只可檢測(cè)到GFP，陽(yáng)性率為24.4％;pLV組有8只可檢測(cè)到GFP，陽(yáng)性率為38.1％。

6、　　(4)雞胚性腺HE染色的結(jié)果顯示，pLV-FOXL2組和pLV組公雞睪丸的組織結(jié)構(gòu)相似，與正常母雞卵巢結(jié)構(gòu)不同。免疫組化的結(jié)果顯示CYP19A1蛋白在pLV-FOXL2組左右側(cè)睪丸中的表達(dá)量與pLV組左右側(cè)睪丸和正常母雞卵巢相當(dāng);FOXL2蛋白在pLV-FOXL2組左右側(cè)睪丸中的表達(dá)量高于pLV組左右睪丸，與正常母雞卵巢中的表達(dá)相似。性別相關(guān)基因的qPCR結(jié)果顯示，在pLV-FOXL2組中，AMH和CYP19A1的表達(dá)量顯著下調(diào)(P

7、＜0.05)，而SOX9的表達(dá)量顯著上調(diào)(P＜0.05)。本試驗(yàn)說(shuō)明，胚胎期FOXL2可能通過(guò)下調(diào)AMH抑制睪丸發(fā)育，使曲精細(xì)管壁變厚，結(jié)締組織增生。
　　(5)將pLV-FOXL2和pLV質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物，通過(guò)睪丸直接注射法從左側(cè)睪丸注入13周齡公雞睪丸中，20天后，觀察公雞雞冠顏色，檢測(cè)兩側(cè)睪丸的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，組織學(xué)結(jié)構(gòu)，免疫組化和性別相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與pLV組相比，pLV-FOXL2組公雞雞冠的顏色明顯變白

8、;pLV-FOXL2組左右測(cè)睪丸曲精細(xì)管變小，曲精管上皮變厚，精子生成出現(xiàn)障礙;免疫組化的結(jié)果顯示，與pLV組比，pLV-FOXL2組睪丸FOXL2和CYP19A1的表達(dá)量增加;性別相關(guān)基因的表達(dá)結(jié)果示顯，在pLV-FOXL2組中，F(xiàn)OXL2和CYP19A1基因的表達(dá)量均顯著高于pLV組(P＜0.05)。本試驗(yàn)說(shuō)明，F(xiàn)OXL2可通過(guò)調(diào)控CYP19A1的表達(dá)來(lái)維持睪丸的功能。
　　本研究的結(jié)果提示，F(xiàn)OXL2可通調(diào)節(jié)AMH和CYP1