黃瓜莖蔓抗白粉病基因的定位研究.pdf

1、白粉?。╬owdery mildew）在世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生，常對(duì)黃瓜生產(chǎn)造成嚴(yán)重的損失。目前，對(duì)黃瓜抗白粉病的研究已有很多報(bào)道，但是對(duì)白粉病抗性遺傳規(guī)律仍存在很大爭(zhēng)議，而且不同學(xué)者定位的位置不一致，這就需要用不同的材料進(jìn)行深入的定位研究。然而，黃瓜莖蔓抗白粉病的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究以莖蔓抗白粉病的NCG122和感白粉病的NCG121為親本構(gòu)建遺傳分離群體（F2、BC1P1、BC1P2），通過(guò)田間病圃自然發(fā)病鑒定對(duì)黃瓜莖蔓抗白粉病基因進(jìn)

2、行遺傳分析和基因定位研究。同時(shí)，利用已完成全基因組重測(cè)序的黃瓜核心種質(zhì)材料進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，以期在整個(gè)基因組范圍內(nèi)挖掘黃瓜莖蔓抗白粉病基因,并對(duì)定位區(qū)域的候選基因進(jìn)行克隆與表達(dá)分析。研究結(jié)果如下：
　　1.根據(jù)鑒定結(jié)果對(duì)黃瓜莖蔓抗白粉病基因進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果顯示：F1均表現(xiàn)為感病；在F2群體中，抗病與感病植株的分離比符合1:3；在 BC1P1回交群體中，抗病與感病的分離比符合1:1；在BC1P2回交群體中，表型全部為感病。因此

3、在本研究中黃瓜莖蔓白粉病抗性是由一對(duì)隱性基因控制的，命名為pm-s。
　　2.用親本NCG122和NCG121從2112對(duì)SSR引物中篩選出282對(duì)表現(xiàn)出多態(tài)性的引物，多態(tài)率為13.4％。經(jīng)分離群體分組分析法（BSA）篩選獲得了10對(duì)與莖蔓抗白粉病基因pm-s連鎖的標(biāo)記，構(gòu)建連鎖圖，將pm-s初步定位于5號(hào)染色體（Chr.5）上。通過(guò)對(duì)初定位區(qū)域進(jìn)行加密，構(gòu)建了一個(gè)包含17個(gè)標(biāo)記，總長(zhǎng)度為20.4cM的遺傳圖譜，平均遺傳距離為1.

4、2cM。其中 pm-s位于兩側(cè)翼標(biāo)記pmSSR27和pmSSR17之間，遺傳距離分別是0.1cM和0.7cM，兩標(biāo)記之間的物理距離是135.7kb。
　　3.通過(guò)擴(kuò)大 F2群體對(duì) pm-s進(jìn)行精細(xì)定位，將 pm-s定位于兩側(cè)翼標(biāo)記 Indelpm-s10和Indelpm-s19之間，連鎖距離分別是0.6和0.8cM，兩標(biāo)記的物理距離是121.8kb（24,816,132-24,937,948bp）。
　　4.利用黃瓜基因組數(shù)

5、據(jù)庫(kù)提供的基因預(yù)測(cè)、注釋結(jié)果，在pm-s定位區(qū)域內(nèi)共預(yù)測(cè)到22個(gè)候選基因。其中Csa5G623470是一個(gè)編碼MLO蛋白的基因，推測(cè)此基因是與莖蔓抗白粉病關(guān)系密切的候選基因。
　　5.利用核心種質(zhì)材料的重測(cè)序信息，結(jié)合四個(gè)季節(jié)的抗病鑒定結(jié)果，對(duì)黃瓜莖蔓白粉病抗性進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，檢測(cè)到4個(gè)抗性信號(hào)位點(diǎn)：pm-sG1.1、pm-sG2.1、pm-sG5.1、pm-sG5.2，其中pm-sG5.1和pm-sG5.2被重復(fù)檢測(cè)到，而

6、且pm-sG5.2與本研究中精細(xì)定位的結(jié)果也一致，表明此抗性位點(diǎn)的可靠性。
　　6.通過(guò)從兩個(gè)親本NCG122和NCG121，三份感白粉病材料（CG1、CG25、CG43）和5份抗白粉病材料（CG7、CG35、CG44、CG107、CG108）中克隆Csa5G623470的全長(zhǎng)和蛋白編碼區(qū)（CDS），發(fā)現(xiàn)抗病材料在DNA水平上第十一個(gè)外顯子上有1449bp的插入，在cDNA水平上第十個(gè)外顯子的末端和第十一個(gè)外顯子上共缺失了177b

7、p，即缺失了59個(gè)氨基酸，CG107除外。通過(guò)對(duì)不同物種中Csa5G623470的蛋白序列進(jìn)行多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，抗病材料中缺失的59個(gè)氨基酸是相對(duì)保守的。通過(guò)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的分析發(fā)現(xiàn)MLO蛋白在黃瓜中的種類較多。
　　7.分別采集接種后0h、4h、8h、24h、48h、4d和6d七個(gè)時(shí)間點(diǎn)的兩親本的幼莖和真葉，對(duì)Csa5G623470的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示，在接種24h后Csa5G623470在抗病親本NCG