豬體細(xì)胞克隆中條件優(yōu)化及程序簡化研究.pdf

1、本試驗(yàn)的目的是優(yōu)化豬核移植技術(shù)條件，探索豬核移植技術(shù)原理，簡化豬核移植方法及程序，提高核移植效率。以便在本實(shí)驗(yàn)室建立高效的動(dòng)物核移植技術(shù)研究平臺(tái)，為進(jìn)一步生產(chǎn)克隆動(dòng)物創(chuàng)造條件。本研究分別以極體排出比率、孤雌激活卵裂比率、核移植重構(gòu)胚胎卵裂比率和8-細(xì)胞以上胚胎生成比例為試驗(yàn)效果的檢測(cè)統(tǒng)計(jì)指標(biāo)，對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟最佳條件和成熟時(shí)間，對(duì)去核、移核方法和激活方式三個(gè)主要環(huán)節(jié)進(jìn)行了研究，優(yōu)化了試驗(yàn)條件，獲得了簡化的核移植技術(shù)程序。 試

2、驗(yàn)表明，以TCM199為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)時(shí)，添加AA或EGF組的成熟率均極顯著高于添加AA+EGF組和對(duì)照組(P＜0.01)，四者的成熟率分別為80.6﹪、81.2﹪、64.4﹪、66.2﹪；其中AA與EGF組間、AA+EGF組和對(duì)照組間的成熟率差異都不顯著(P＞0.05)。對(duì)各組成熟的卵母細(xì)胞孤雌激活后發(fā)現(xiàn)：AA與EGF組的卵裂率無顯著差異(74.8﹪vs74.2﹪，P＞0.05)，但都極顯著高于AA+EGF組和對(duì)

3、照組(61.5﹪、63.4﹪，P＜0.01)；AA、EGF、AA+EGF和對(duì)照組的8-細(xì)胞以上胚胎比例分別為32.6﹪、35.5﹪、26.9﹪、28.1﹪，其中AA與EGF組均極顯著高于AA+EGF和對(duì)照組(P＜0.01)，EGF組顯著高于AA組(P＜0.05)，AA+EGF和對(duì)照組間差異不顯著(P＞0.05)。上述結(jié)果表明在豬卵母細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)添加一定量AA或EGF能提高其成熟率和卵母細(xì)胞質(zhì)量。 豬卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)39～48h內(nèi)，

4、隨培養(yǎng)時(shí)間的延長卵母細(xì)胞成熟率逐漸升高，而去核率卻逐次降低，在39～41h、42～44h、45～48h三個(gè)時(shí)間段豬卵母細(xì)胞的成熟率分別為70.8﹪、80.1﹪、81.2﹪，去核率分別為82.4﹪、82.2﹪、79.6﹪。隨后的核移植重組胚培養(yǎng)結(jié)果表明：39～41h組的卵裂率極顯著低于42～44h組(37.2﹪vs41.8﹪)和45～48h組(37.2﹪vs43.0﹪，P＜0.01)，8-細(xì)胞以上的胚胎比例也顯著低于42～44h組(15.

5、0﹪vs17.5﹪，P＜0.05)，同時(shí)極顯著低于45～48h組(15.0﹪vs20.9﹪，P＜0.01)；45～48h組的卵裂率和8-細(xì)胞以上的胚胎比例均高于42～44h組，但兩組間的差異不顯著(P＞0.05)。因此，綜合考慮，核移植時(shí)選用體外成熟45～48h的豬卵母細(xì)胞能提高總體去核效率和重組胚的發(fā)育能力。 去核時(shí)，盲吸法的去核率極顯著低于熒光染色去核法(80.0﹪vs91.8﹪，P＜0.01)，隨后盲吸法去核構(gòu)建的重組胚卵

6、裂率和8-細(xì)胞以上胚胎比例均高于熒光染色去核法，但差異不顯著(42.9﹪vs41.7﹪，23.1﹪vs19.7﹪，P＞0.05)。說明熒光染色去核法不僅可以提高去核效率，而且對(duì)卵母細(xì)胞也沒有明顯損傷。 構(gòu)建重組胚時(shí)，卵周隙注射法比胞質(zhì)內(nèi)注入體細(xì)胞核和胞質(zhì)內(nèi)注入完整體細(xì)胞法的卵裂率要高(47.4﹪vs44.0﹪，47.4﹪vs44.4﹪，P＜0.05)，但8-細(xì)胞以上的胚胎比例差異不顯著(22.8﹪vs21.8﹪，22.8﹪vs2

7、1.5﹪，P＞0.05);胞質(zhì)內(nèi)注入體細(xì)胞核與胞質(zhì)內(nèi)注入完整體細(xì)胞的卵裂率和8-細(xì)胞以上的胚胎比例差異均不顯著(44.0﹪vs44.4﹪，21.8﹪vs21.5﹪，P＞0.05)。而胞質(zhì)內(nèi)注射完整體細(xì)胞步驟更簡單，說明這種移核方法是簡便可行的。 注核液中含CB與否對(duì)隨后核移植重組胚的卵裂率和發(fā)育到8-細(xì)胞以上的胚胎比例都沒有顯著影響(44.3﹪vs43.9﹪，19.9﹪vs21.2﹪，P＞0.05)。因此去核后，可不換操作針而在

8、去核液中直接完成移核。 核移植重組胚經(jīng)電激活+6-DMAP處理或電激活+6-DMAP+CB處理后的卵裂率和8-細(xì)胞以上的胚胎比例差異均不顯著(44.2﹪vs44.6﹪，22.3﹪vs21.9﹪，P＞0.05)，但兩處理組重組胚的卵裂率和8-細(xì)胞以上胚胎比例都極顯著高于單獨(dú)使用電激活處理組(38.1﹪，19.3﹪，P＜0.01)。上述結(jié)果說明雖然單次電脈沖能夠激活卵母細(xì)胞，但結(jié)合6-DMAP聯(lián)合使用能顯著提高激活效率和之后核移植重