狂犬病病毒誘導(dǎo)人和鼠神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞自噬的研究.pdf

1、狂犬病（rabies）是由狂犬病病毒（rabies virus,RABV）感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)而引起的一種烈性人獸共患傳染病。感染狂犬病病毒并出現(xiàn)臨床癥狀的人或動物幾乎百分之百死亡。預(yù)防和治療狂犬病成為近幾十年的重要課題之一，目前狂犬病以預(yù)防為主，而在治療方面成效寥寥。病毒是一種專性細(xì)胞寄生生物，其依賴生物體復(fù)制和傳播，因此，探討狂犬病病毒與細(xì)胞的生物互作尤為重要。
　　自噬，作為一種細(xì)胞自我保護(hù)性機制，進(jìn)化上高度保守，廣泛存在于真核

2、生物，其主要功能是將細(xì)胞內(nèi)生物大分子及損壞的細(xì)胞器在溶酶體內(nèi)消化分解后供生物體重新利用，與凋亡、壞死一起稱為三大細(xì)胞死亡機制。自噬按其功能分為大自噬、微自噬和分子伴侶介導(dǎo)的自噬。
　　自噬和病毒關(guān)系的研究近些年報道較多，有些病毒具備了逃逸宿主細(xì)胞自噬的功能，有些病毒在長期的進(jìn)化中學(xué)會了如何利用細(xì)胞自噬來促進(jìn)自身轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。彈狀病毒科的其他成員：水皰性口炎病毒(VSV),出血性敗血癥病毒(VHSV)和鯉春病毒血癥病毒(SVCV)能夠

3、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，但對于狂犬病病毒與細(xì)胞自噬關(guān)系的研究目前尚未報道，本研究從以下幾個方面對狂犬病毒與細(xì)胞自噬的關(guān)系進(jìn)行探討。
　　一、狂犬病病毒的感染誘導(dǎo)SK和NA細(xì)胞發(fā)生自噬。為了明確狂犬病病毒是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，我們選擇生物學(xué)特性截然不同的兩株狂犬病病毒：強毒株GD-SH-01和弱毒株HEP-Flury病毒，通過對兩株病毒感染SK和NA細(xì)胞后的western-blot檢測，電鏡觀察以及轉(zhuǎn)染GFP-LC3B質(zhì)粒后觀察GFP熒光點分

4、布的方法，我們最終確定狂犬病病毒強毒株GD-SH-01株病毒可以誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞自噬，而弱毒株的自噬水平與未感染狂犬病病毒的空白細(xì)胞組相似。以上實驗結(jié)果證明細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)是病毒株特異的。自噬誘導(dǎo)差異是否與強弱毒株特性相關(guān)還有待探討。
　　二、狂犬病病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與凋亡的關(guān)系。細(xì)胞自噬作為一把雙刃劍，既是一種細(xì)胞保護(hù)性機制又可以誘導(dǎo)細(xì)胞走向死亡。細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡同為細(xì)胞程序性死亡，其相關(guān)研究已有很多報道，主要概括為合作關(guān)系、對抗

5、關(guān)系及推動關(guān)系。我們的實驗結(jié)果證明狂犬病病毒強毒株GD-SH-01可以同時誘導(dǎo)細(xì)胞自噬和凋亡，接著我們探討了狂犬病病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬和凋亡的關(guān)系。我們通過增強其中一種現(xiàn)象來看另一種發(fā)生的變化的方法來進(jìn)行研究，結(jié)果顯示在加入自噬增強劑的細(xì)胞組狂犬病病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯弱于未加藥物組，這個現(xiàn)象說明GD-SH-01誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬是作為一種細(xì)胞保護(hù)性機制來消除病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡這種不利細(xì)胞存活的生物學(xué)過程。
　　三、GD-SH-01

6、的M基因?qū)ψ允傻挠绊?。狂犬病病毒的基因組由5個結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成：N，P，M，G，L，那么究竟是哪個基因在狂犬病病毒誘導(dǎo)細(xì)胞自噬方面起到最關(guān)鍵的作用呢，我們實驗室通過將GD-SH-01的單個結(jié)構(gòu)蛋白基因與相對應(yīng)HEP-Flury基因進(jìn)行替換和病毒拯救，得到5株重組狂犬病病毒：rHEP-shN、rHEP-shP、rHEP-shM、rHEP-shG和rHEP-shL，通過對其感染細(xì)胞后細(xì)胞自噬水平的研究得出rHEP-shM與GD-SH-01一樣可

7、以誘導(dǎo)明顯的LC3-I/LC3-II轉(zhuǎn)換，而rHEP-shN、rHEP-shP、和rHEP-shG只能誘導(dǎo)較弱的細(xì)胞自噬。從而初步得出GD-SH-01的M基因在誘導(dǎo)細(xì)胞自噬方面起到最主要的作用。接下來，我們構(gòu)建了4個質(zhì)粒，它們分別可以表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白與mRFP蛋白融合的融合蛋白。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后我們發(fā)現(xiàn)單個蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)并不能誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，因此GD-SH-01誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬是與病毒粒子的特性有關(guān)而不是單個狂犬病病毒結(jié)構(gòu)蛋白可以誘導(dǎo)的。