肝素治療膿毒癥的效果評(píng)價(jià)及窖蛋白-1在其抗炎過程中的作用.pdf

1、膿毒癥（sepsis）被定義為感染及其導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，炎癥反應(yīng)的過度激活及免疫失衡是膿毒癥的本質(zhì)特征，因此，在膿毒癥早期控制促炎因子的過度釋放、恢復(fù)免疫平衡，從而達(dá)到保護(hù)器官功能，改善預(yù)后的目的，這已成為膿毒癥研究的核心問題。
　　普通肝素(unfractioned heparin，UFH)抗凝效果確切，在臨床上廣泛應(yīng)用于防治血栓栓塞性疾病、DIC的早期治療。除此之外，肝素還具有廣泛的抗炎作用，可明顯降低炎癥

2、介質(zhì)表達(dá)，降低凝血活化，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞完整性，從而可能降低膿毒癥病人的多器官功能障礙的發(fā)生及病死率。而針對(duì)膿毒癥病人的3個(gè)有關(guān)抗凝劑的大樣本Ⅲ期臨床試驗(yàn)的安慰劑組病例分析同樣表明，肝素組較未應(yīng)用肝素組似乎有更高的生存率。雖然近年來，臨床應(yīng)用肝素治療膿毒癥的隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)開始出現(xiàn)，但針對(duì)其有效性及安全性的評(píng)估結(jié)果并不一致。
　　目前，肝素并未作為抗炎藥物應(yīng)用于臨床，除了對(duì)其出血的不良反應(yīng)的擔(dān)憂，對(duì)其復(fù)雜抗炎機(jī)制的認(rèn)識(shí)不足也是一個(gè)重要原因

3、。肝素抗炎作用的機(jī)制和確切作用位點(diǎn)尚不完全清楚。作為帶負(fù)電荷的大分子物質(zhì)，肝素通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)十分緩慢，低濃度時(shí)甚至尚未形成完成的囊泡便已被降解代謝。有證據(jù)表明，低至1μg/ml的肝素可在2分鐘以內(nèi)通過調(diào)控細(xì)胞表面的Erk及鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶(CaMK)活化產(chǎn)生作用，而與細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶R的直接結(jié)合作用需要100μg/ml的肝素72小時(shí)以后才能發(fā)揮作用。因此，低劑量肝素的效果至少部分應(yīng)作用于細(xì)胞外。
　　胞膜窖是細(xì)胞膜上富

4、含膽固醇和鞘磷脂的壺腹?fàn)畎枷?，參與了廣泛的細(xì)胞作用過程。窖蛋白是胞膜窖的外殼蛋白，屬于嵌膜蛋白質(zhì)(integral membrane protein)家族成員，在不同的細(xì)胞中有些特定的功能，而窖蛋白-1(caveolin-1，Cav-1)可能是體內(nèi)炎癥細(xì)胞潛在的重要免疫調(diào)節(jié)分予，并且在炎癥信號(hào)傳導(dǎo)過程中處于軸心位置，這其中包括巨噬細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道，不同免疫細(xì)胞所表達(dá)的Cav-1在感染或炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了極其重要的調(diào)節(jié)作用。
　　有趣

5、的是，有文章報(bào)道，肝素能夠調(diào)控Cav-1的表達(dá)和亞細(xì)胞定位，然而在炎癥過程中，他們之間是否存在相關(guān)性尚未被證實(shí)。揭示Cav-1參與炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制能夠進(jìn)一步理解Cav-1的功能，以幫助我們尋找治療與炎癥相關(guān)疾病新的靶點(diǎn)。
　　材料和方法:
　　一、研究對(duì)象
　　論文一針對(duì)肝素治療膿毒癥病人的有效性及安全性進(jìn)行系統(tǒng)綜述，通過計(jì)算機(jī)檢索MEDLINE數(shù)據(jù)庫、Cochrane圖書館、科學(xué)引文索引擴(kuò)展板數(shù)據(jù)庫(SCIE)、

6、中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(CBM)、中國知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施工程數(shù)據(jù)庫(CNKI)、維普數(shù)據(jù)庫、萬方數(shù)據(jù)庫，檢索時(shí)限均從2000年1月至2012年6月，納入肝素治療膿毒癥的隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)17個(gè)，共1167例膿毒癥病人。
　　論文二、論文三及中實(shí)驗(yàn)用小鼠腹腔巨噬細(xì)胞均分離自未注射刺激物的C57BL/6小鼠。
　　二、實(shí)驗(yàn)材料
　　DMEM培養(yǎng)基、PBS、FBS、LPS、普通肝素、SB203580、NP-40裂解液、PMSF、BC

7、A蛋白濃度測(cè)定試劑盒、一抗二抗去除液、TEMED、預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、PVDF膜、ECL發(fā)光液、BSA、脫脂奶粉、羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP、Mouse antiβ-actin-HRP、胎牛血清、脂質(zhì)體2000、Super M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、RNAsimple Total RNA Kit、RNase固相清除劑、Powder瓊脂糖、50×TAE、2×Power TaqPCR MasterMix、SYBR Green、小

8、鼠TNF-α、IL-6、IL-8及IL-1β ELISA檢測(cè)試劑盒。
　　三、實(shí)驗(yàn)方法
　?。ㄒ唬┖Y選所有符合納入標(biāo)準(zhǔn)的肝素治療膿毒癥的RCT研究，并采用Cochrane系統(tǒng)評(píng)價(jià)員手冊(cè)5.1.0推薦的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，對(duì)28天病死率、出血、凝血指標(biāo)變化、住院時(shí)間、病情改善及器官保護(hù)進(jìn)行數(shù)據(jù)提取，采用Revman5.1進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。
　?。ǘ〦LISA檢測(cè)炎癥因子蛋白表達(dá)情況;Western blot檢測(cè)c

9、aveolin-1蛋白及MAPK信號(hào)分子蛋白表達(dá);siRNA轉(zhuǎn)染下調(diào)caveolin-1表達(dá);RT-PCR檢測(cè)caveolin-1及炎癥因子mRNA轉(zhuǎn)錄情況。
　　四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　論文一統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Revman5.1軟件完成。結(jié)果數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有原始數(shù)據(jù)使用單向方差分析進(jìn)行(ANOVA)，然后通過Bonferroni檢驗(yàn)進(jìn)行多組兩兩比較。P＜0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　一、肝素

10、治療膿毒癥的有效性及安全性
　　1、與對(duì)照組相比，肝素能顯著降低膿毒癥患者28天病死率，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[OR=0.59，95 CI(0.45，0.77)，P=0.0001]。
　　2、小劑量肝素治療的病例中嚴(yán)重出血發(fā)生率很低。
　　3、肝素治療未導(dǎo)致血小板計(jì)數(shù)明顯下降，相反有助于糾正血小板降低[MD=13.94，95 CI(10.15，17.72)，P＜0.00001]，肝素對(duì)PT及APTT影響與對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差

11、異。
　　4、肝素對(duì)病人住院時(shí)間無明顯影響，但可縮短住ICU時(shí)間[MD=-4.43，95 CI(-6.79,-2.07),P=0.0002]。
　　5、肝素治療后膿毒癥病人APACHEⅡ評(píng)分明顯降低[MD=-2.58，95 CI(-3.29，-1.87)，P＜0.00001]，MODS發(fā)生率明顯降低[OR=0.32，95 CI(0.17，0.61)，P=0.0006]。
　　二、肝素通過p38 MAPK通路抑制脂多糖誘

12、導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄與表達(dá)
　　1、與對(duì)照組相比，100ng/ml LPS可誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β濃度分別增高2.74，4.30，4.04和4.54倍，mRNA轉(zhuǎn)錄分別增高2.28，2.52，1.99和2.84倍。
　　2、與單純LPS刺激組比較，同時(shí)加用20μg/ml肝素能夠使TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β濃度分別降低37.4，45.5％，42％和35.7

13、％，mRNA轉(zhuǎn)錄水平也相應(yīng)被抑制36％，35.7％，36.7％和44.4％，單純加用肝素對(duì)TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β濃度及mRNA轉(zhuǎn)錄均無明顯影響。
　　3、與對(duì)照組相比，100ng/ml LPS刺激下，巨噬細(xì)胞p-ERK、p-JNK、p-p38濃度明顯升高1.66，1.94和2.72倍，但ERK，JNK和p38 MAPK均無明顯變化。與單純LPS刺激組比較，同時(shí)加用20μg/ml肝素能夠使p-p38上升1.56倍

14、，卻使p-JNK下降41.3％，而對(duì)p-ERK無明顯影響。
　　4、與LPS+DMSO組相比，同時(shí)加用肝素能夠使TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β濃度分別降低41.7％，52.2％，44.1％，41.9％;與LPS+DMSO+肝素組比較，LPS+肝素+SB203580組TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β濃度明顯增高(p＜0.05)，與LPS+DMSO組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＞0.05)，SB203580明顯減弱了肝素抑制

15、炎癥因子表達(dá)的作用。
　　三、caveolin-1是肝素抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的關(guān)鍵分子
　　1、成功構(gòu)建siRNA介導(dǎo)caveolin-1低表達(dá)巨噬細(xì)胞，與陰性對(duì)照及正常對(duì)照巨噬細(xì)胞相比，caveolin-1蛋白及mRNA表達(dá)分別下降75％和80％。
　　2、陰性對(duì)照及Cav-1低表達(dá)巨噬細(xì)胞在LPS誘導(dǎo)下，炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β濃度均明顯升高，而且Cav-1

16、低表達(dá)巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)水平比陰性對(duì)照細(xì)胞更高，然而，后者能夠被肝素明顯抑制，而前者卻不明顯。單獨(dú)給予肝素對(duì)轉(zhuǎn)染的巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)無明顯影響。
　　3、在等量肝素作用下，p-p38 MAPK在正常及陰性對(duì)照巨噬細(xì)胞的表達(dá)無差異，而在Cav-1低表達(dá)巨噬細(xì)胞表達(dá)下降49％。
　　結(jié)論:
　　1、小劑量肝素可降低膿毒癥病人的病死率，改善預(yù)后，且安全性較高。
　　2、LPS誘導(dǎo)上調(diào)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞炎癥因子TNF-