白細胞介素18(IL-18)調(diào)節(jié)大鼠肝細胞增殖的分子機制研究.pdf

1、肝臟是機體的重要器官，具有極強的再生能力。肝再生（liver regeneration, LR）過程受機體的精密調(diào)控，包括細胞因子和生長因子在內(nèi)的多種功能蛋白參與，涉及多條信號通路的交互作用。白細胞介素18（interleukin18, IL-18）是一個多效性的細胞因子，除具較強的γ-干擾素誘生能力外，還可增強NK細胞毒性，刺激T細胞、成骨、生殖細胞等細胞增殖，刺激產(chǎn)生粒細胞巨噬細胞刺激因子，調(diào)節(jié)細胞間粘附因子等。然而，迄今為止，IL

2、-18對肝細胞增殖的調(diào)節(jié)作用及其分子機制尚未見報道。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、庞蒙锔咄繖z測技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)方法對IL-18在大鼠肝再生中對肝細胞增殖的作用進行了理論分析和功能預(yù)測。首先，根據(jù)GenMAPP、KEGG、QIAGEN等網(wǎng)站資料查找IL-18通路網(wǎng)絡(luò)圖并匯總通路相關(guān)基因。其次，根據(jù)TRED、Lymph TF-DB等網(wǎng)站資料查找通路中的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)的靶基因，這些靶基因再經(jīng)NCBI網(wǎng)站上“Gene Ont

3、ology”篩選得到與細胞增殖相關(guān)的靶基因。然后，制備大鼠2/3肝切除模型（partial hepatectomy, PH），分離再生肝的肝細胞，用Rat Genome2302.0芯片檢測上述基因在大鼠肝再生中的表達變化。最后，用譜函數(shù)Ep(t)分析它們的協(xié)同作用預(yù)示的生理活動。結(jié)果表明，IL-18信號通路包括NF-κB、p38/ATF2、JNK3條途徑，涉及33個通路相關(guān)基因和受通路調(diào)節(jié)的395個靶基因。其中，13個通路相關(guān)基因和49

4、個與細胞增殖相關(guān)的靶基因在大鼠肝再生中發(fā)生有意義的表達變化。此外，IL-18信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活動與該通路調(diào)節(jié)的細胞增殖活動（Ep(t)值）于PH后12-72h顯著高于對照組（P＜0.05）。其中，NF-κB途徑和該途徑調(diào)節(jié)的細胞增殖相關(guān)靶基因的基因協(xié)同值分別于PH后2-36h和6-72h顯著高于對照組（P＜0.05）；p38/ATF2途徑和該途徑調(diào)節(jié)的細胞增殖相關(guān)靶基因的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活動分別于2h、24-120h和2-72h顯著高于對照組

5、（P＜0.05）；JNK途徑和該途徑調(diào)節(jié)的細胞增殖相關(guān)靶基因的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活動分別于2h、12-72h和6-24h、72h顯著高于對照組（P＜0.05）。這些研究結(jié)果表明，IL-18可能通過NF-κB、p38/ATF2和JNK途徑在大鼠肝再生的啟動和進展階段促進肝細胞增殖。
　?、蒲芯苛薎L-18對大鼠正常肝細胞系BRL-3A的增殖調(diào)節(jié)作用。首先，用qRT-PCR和Western blot方法檢測BRL-3A細胞周期中IL-18的表達

6、變化。其次，通過重組大鼠IL-18蛋白（recombinant rat IL-18, rrIL-18）和小干擾 RNA（shortinterference RNA, siRNA）處理細胞，MTT和BrdU摻入法檢測細胞增殖情況，流式細胞術(shù)檢測細胞周期分布情況。最后，用qRT-PCR和Western blot方法檢測IL-18通路相關(guān)基因和受通路調(diào)節(jié)的細胞增殖相關(guān)靶基因的表達變化。結(jié)果表明，同步化的BRL-3A細胞重新進入細胞周期后3.3

7、h（G0/G1）和8.6h（G1/S）時，IL-18的mRNA和蛋白水平顯著升高。用 siRNA干涉 IL-18表達后48h，細胞活力明顯低于陰性對照組（negative control, NC）（P＜0.05），G2/M期的細胞比率也低于NC組。此外，5-10ng/ml的rrIL-18處理細胞后24h和48h，細胞活力顯著高于對照組（P＜0.05）。同時，實驗組的BrdU陽性細胞比率也明顯升高（P＜0.05）。qRT-PCR和West

8、ern blot結(jié)果顯示，NF-κB途徑上游的募集蛋白MyD88、NF-κB及其調(diào)節(jié)的靶蛋白cyclin B1、cyclin B2均顯著高于對照組；p38/ATF2途徑的轉(zhuǎn)錄因子ATF2及其調(diào)節(jié)的靶蛋白cyclin A2和Bcl-2亦表達上調(diào)，用siRNA干涉BRL-3A細胞的IL-18表達，這些基因和蛋白的表達水平也隨之降低。因此，我們推測 IL-18通過 NF-κB和 p38/ATF2途徑，進一步激活與細胞增殖相關(guān)的靶基因CCNB1

9、、CCNB2、CCNA2和Bcl-2的轉(zhuǎn)錄和表達，從而調(diào)節(jié)BRL-3A大鼠肝細胞增殖。
　　⑶用qRT-PCR和Western blot方法檢測大鼠肝再生中IL-18在再生肝中的表達變化，用酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）檢測大鼠肝再生中IL-18在下腔靜脈血漿中的含量變化。其次，將rrIL-18通過尾靜脈注入PH大鼠體內(nèi)，用BrdU免疫熒光法檢測再生肝的細胞增

10、殖情況，然后，用qRT-PCR和Western blot方法檢測IL-18通路相關(guān)基因及受通路調(diào)節(jié)的細胞增殖相關(guān)靶基因的表達變化。結(jié)果表明，IL-18的mRNA于PH后2h和36h顯著升高（P＜0.05），12h和72h恢復(fù)至正常水平。同時，下腔靜脈血漿中IL-18含量也于PH后2h開始升高，12h和48h兩次達到高峰（P＜0.05）。此外，大鼠PH后立即注射rrIL-18，24h時檢測再生肝的BrdU陽性細胞，結(jié)果表明4μg/只注射劑

11、量組的BrdU陽性細胞比率顯著高于對照組（P＜0.01）。qRT-PCR和Western blot結(jié)果表明， rrIL-18處理PH大鼠后24h，再生肝中的募集蛋白MyD88、轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及其調(diào)節(jié)的靶蛋白cyclin B1和cyclin B2的表達量顯著高于對照組；p38/ATF2途徑調(diào)節(jié)的靶蛋白cyclin A2和Bcl-2亦表達上調(diào)，這些研究結(jié)果與其調(diào)節(jié)體外培養(yǎng)的大鼠肝細胞增殖的機制相一致。以上結(jié)果表明，大鼠肝再生中IL-18