由18個(gè)堿基缺失導(dǎo)致I型遺傳性抗凝血酶缺乏癥的基因和功能分析.pdf

1、本文從以下幾個(gè)方面進(jìn)行論述。
　　第一部分：
　　目的:
　　抗凝血酶作為抗凝血系統(tǒng)中不可或缺的一種蛋白酶，其家系的研究可為出凝血的遺傳性疾病提供有力的依據(jù)。而本次研究探討1例Ⅰ型遺傳性抗凝血酶(AT)缺陷癥家系的表型及基因型關(guān)系。
　　方法：
　　1)對(duì)遺傳性抗凝血酶缺乏癥患者及家系成員進(jìn)行血常規(guī)，凝血功能，D-Dimer水平的檢測(cè)，并采集病史。
　　2)用ELISA法檢測(cè)血漿中抗凝血酶抗原（AT:

2、Ag），蛋白C抗原（PC:Ag)，用發(fā)色底物法檢測(cè)血漿中抗凝血酶活性（AT:A）和蛋白C活性(PC:A），凝固法檢測(cè)蛋白S活性（PS:A）。
　　3)利用凝血酶生成通過(guò)擴(kuò)增和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR-RFLP）對(duì)新發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)的進(jìn)行驗(yàn)證。
　　7）通過(guò)測(cè)序檢測(cè)家系中是否存在其它常見(jiàn)的遺傳性凝血因子突變位點(diǎn)。
　　8）生物信息軟件 Sorting Intolerant From Tolerant(S

3、IFT)， Polymorphism Phentyping-2(PolyPhen-2)，Mutation Taster和Protein Variation Effect Analyzer（PROVEAN）對(duì)缺失突變的評(píng)估，DNAMAN軟件對(duì)突變氨基酸保守度分析和Swiss Model對(duì)蛋白分子結(jié)構(gòu)模擬。
　　結(jié)果：
　　1）該家系的先證者為反復(fù)發(fā)作的靜脈血栓患者，但家系其他成員均無(wú)血栓發(fā)生。先證者入院接受抗凝治療后凝血功能提

4、示PT，APTT，INR均延長(zhǎng)，分別為26.6s，48.6s和2.57，其血常規(guī)，D-Dimer水平檢查結(jié)果均無(wú)異常，家系其他成員血常規(guī)，凝血功能，D-Dimer水平均無(wú)異常。
　　2）先證者的AT:A為正常人(100％)的39.2％，AT:Ag為正常人（100％）的41.9％，提示為I型遺傳性抗凝血酶缺乏。家系成員中先證者的母親和侄女的AT:A和AT:Ag均有所降低，其余成員無(wú)異常。
　　3）凝血酶生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示先證者及

5、其母親和侄女的峰值高于正常人群，提示其血液存在高凝狀態(tài)。
　　4）先證者的DNA抽提后，通過(guò)AT基因測(cè)序顯示在AT第5個(gè)外顯子(外顯子5)存在18個(gè)堿基缺失突變,導(dǎo)致c.1061_1078del。其母親和侄女均存在相同雜合突變。
　　5）TA克隆測(cè)序發(fā)現(xiàn)一條正常DNA鏈和一條18個(gè)堿基缺失的DNA鏈。
　　6）酶切結(jié)果提示100例正常人中未見(jiàn)此雜合突變，證明該突變不是基因多態(tài)性。
　　7）檢測(cè)遺傳性凝血因子的常見(jiàn)

6、突變位點(diǎn)，測(cè)序結(jié)果顯示先證者及其父親和侄女均存在纖維蛋白原FGG C10034T雜合突變，先證者及其母親存在MTHFR C667T雜合突變，所有人均未發(fā)現(xiàn)FV Leiden突變和PT G20210A突變。
　　8）通過(guò)生物信息學(xué)軟件比對(duì)后提示是一個(gè)病理性的有害突變。
　　結(jié)論：
　　根據(jù)先證者臨床癥狀、體征，結(jié)合家族史及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果，診斷為遺傳性抗凝血酶缺乏癥，并通過(guò)抗凝血酶抗原和活性的檢測(cè)確定為I型遺傳性抗凝血酶缺

7、乏癥。AT基因第5個(gè)外顯子（外顯子5）出現(xiàn)的AT c.1061_1078del雜合突變，為國(guó)際上首次報(bào)道。同時(shí)先證者的母親和侄女（胞妹的女兒）也存在該位點(diǎn)的雜合突變，說(shuō)明該突變來(lái)源于先證者母親，通過(guò)基因和蛋白水平的調(diào)控，造成血液的高凝狀態(tài)。
　　第二部分
　　目的：研究該雜合突變導(dǎo)致遺傳性抗凝血酶缺乏癥的分子機(jī)制，并對(duì)AT的結(jié)構(gòu)和功能的變化進(jìn)行體外功能實(shí)驗(yàn)的分析。完善疾病的診斷治療和預(yù)后方案，加深對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)。
　　方

8、法：
　　1）構(gòu)建AT野生型和突變型重組表達(dá)質(zhì)粒。
　　2）細(xì)胞培養(yǎng)，分別將AT的野生型及突變型重組表達(dá)質(zhì)粒，與eGFP-PEZ-M02質(zhì)粒共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到HEK293T細(xì)胞。
　　3）qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。
　　4）蛋白印跡分析細(xì)胞培養(yǎng)基上清中AT的含量和相對(duì)分子量。5）間接免疫熒光和激光共聚焦對(duì)AT蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。
　　6）通過(guò)發(fā)色底物法和ELISA的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清的A

9、T活性和抗原。
　　結(jié)果：
　　1)構(gòu)建的野生型表達(dá)質(zhì)粒為AT-WT，突變型重組表達(dá)質(zhì)粒為AT-MT。
　　2)通過(guò)共同轉(zhuǎn)染，熒光顯微鏡觀察HEK293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率基本相同，約為80％。
　　3)蛋白印跡結(jié)果顯示突變型重組表達(dá)質(zhì)粒在細(xì)胞上清中分泌的蛋白分子量和表達(dá)量均低于野生型。
　　4) qRT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染AT-MT的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平明顯降低，約為野生型AT-WT的0.125倍。
　　5)免疫

10、熒光結(jié)果顯示突變型AT-MT表達(dá)的AT蛋白在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的染色程度與野生型相似，但在高爾基復(fù)合體的染色較野生型明顯減弱。
　　6)突變型AT-MT的細(xì)胞上清中AT:Ag和AT:A均明顯低于野生型。
　　結(jié)論：
　　體外功能研究證實(shí)18個(gè)堿基的缺失是造成患者血漿中抗凝血酶缺乏的根本原因。該突變引起細(xì)胞內(nèi)ATmRNA表達(dá)下降，并且在高爾基復(fù)合體加工過(guò)程中導(dǎo)致分泌蛋白的含量和活性同時(shí)減少。先證者需及時(shí)給予抗凝治療，制定長(zhǎng)期抗凝