誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞治療視網(wǎng)膜變性疾病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　視網(wǎng)膜色素上皮(retinalpigmentepithelial，RPE)細(xì)胞的變性、壞死和丟失可造成視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜的損害，導(dǎo)致視網(wǎng)膜變性類疾病的發(fā)生和視力下降。目前尚無有效治療RPE變性的方法。細(xì)胞移植是治療RPE細(xì)胞變性的具有前景的方法，但是如何獲得數(shù)量充足的、低免疫排斥和低成瘤風(fēng)險(xiǎn)的RPE細(xì)胞是目前細(xì)胞治療RPE變性的所面臨的主要問題。而在可用于視網(wǎng)膜變性疾病治療的干細(xì)胞中，胚胎干細(xì)胞（embryoni

2、cstemcells，ESCs）因其全能分化特性（可分化為包括RPE在內(nèi)的體內(nèi)所有細(xì)胞類型）和無限增殖能力，被認(rèn)為是可用于視網(wǎng)膜變性類疾病治療的重要種子細(xì)胞。然而，ESCs來源的治療細(xì)胞的免疫排斥和成瘤風(fēng)險(xiǎn)、以及不可控增殖、倫醫(yī)學(xué)等問題限制了ESCs的臨床轉(zhuǎn)化。和ESCs相比，目前已在臨床廣泛應(yīng)用的自體成體干細(xì)胞可避免免疫排斥和成瘤風(fēng)險(xiǎn)，且自體取材可規(guī)避倫理障礙。在本課題中，我們重點(diǎn)研究是否能將成體干細(xì)胞中的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesench

3、ymalstemcells，MSCs)誘導(dǎo)分化為RPE樣的細(xì)胞，并且具備天然RPE細(xì)胞的生理功能，并最終轉(zhuǎn)化成為治療視網(wǎng)膜變性類疾病的理想種子細(xì)胞。
　　方法:
　　1、hMSCs和豬RPE細(xì)胞的分離
　　(1)原代分離和純化獲得hMSCs和豬RPE細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài);
　　(2)hMSCs和豬RPE細(xì)胞標(biāo)記檢測(cè)、hMSCs成骨誘導(dǎo)分化鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色、成軟骨誘導(dǎo)分化甲苯胺藍(lán)染色和成脂肪誘導(dǎo)分化油紅-0染色鑒定h

4、MSCs;免疫熒光鑒定豬RPE細(xì)胞。
　　2、hMSCs和豬RPE的共培養(yǎng)及其向RPE細(xì)胞的分化
　　(1)Transwell共培養(yǎng)法誘導(dǎo)hMSCs向RPE細(xì)胞分化;條件培養(yǎng)基法誘導(dǎo)hMSCs向RPE細(xì)胞分化;
　　(2)hMSCs來源RPE細(xì)胞的鑒定
　　細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞內(nèi)色素含量的定量分析、透射電鏡檢測(cè)、Real-timePCR、免疫熒光染色檢測(cè)、吞噬實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞斷層掃描、WesternBlot、驗(yàn)證MER

5、TK蛋白在誘導(dǎo)細(xì)胞特異性吞噬功能中的作用和誘導(dǎo)細(xì)胞的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌能力檢測(cè)。
　　3、hMSCs來源RPE細(xì)胞對(duì)急、慢性視網(wǎng)膜變性的修復(fù)作用
　　(1)碘酸鈉注射制備急性視網(wǎng)膜變性大鼠模型及鑒定:HE染色和F-ERG檢測(cè);
　　(2)急性視網(wǎng)膜變性大鼠模型視網(wǎng)膜下腔移植分別于移植后4周、8周檢測(cè)以下指標(biāo):細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、免疫熒光染色檢測(cè)hESCs來源的RPE細(xì)胞、吞噬實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞斷層掃描、移植后免疫熒光染色檢測(cè)、F-E

6、RG和WesternBlot。
　　(3)選取21天齡的RCS白化大鼠進(jìn)行視網(wǎng)膜下腔移植，分別于移植后4周、8周檢測(cè)以下指標(biāo):外核層厚度的測(cè)量、移植后細(xì)胞的免疫熒光染色檢測(cè)、F-ERG和WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞在體的吞噬能力。
　　結(jié)果:
　　1、hMSCs的鑒定
　　(1)hMSCs形態(tài)多為梭形成纖維細(xì)胞樣外觀，呈旋渦狀排列;豬RPE細(xì)胞外形呈多邊形，細(xì)胞內(nèi)充滿了棕黑色的色素顆粒;
　　(2)hMS

7、Cs的表面標(biāo)志CD73、CD90、CD105表達(dá)強(qiáng)陽性，而CD14、CD45、CD34陰性;茜素紅染色后，細(xì)胞間出現(xiàn)致密的、圓形不透光團(tuán)塊狀的紅色結(jié)節(jié);阿新藍(lán)染色可見細(xì)胞外基質(zhì)被染成藍(lán)色，成條索狀錯(cuò)綜排列;油紅-0染色細(xì)胞中含有被染成紅色的脂肪顆粒;豬RPE細(xì)胞CRALBP、RPE65、ZO-1表達(dá)均為陽性。
　　2、hMSCs向RPE細(xì)胞的分化
　　(1)hMSCs共培養(yǎng)誘導(dǎo)后的RPE樣細(xì)胞可觀察到hMSCs中出現(xiàn)豐富的色

8、素顆粒，含量接近于成體豬的RPE細(xì)胞，而采用條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)法獲得細(xì)胞色素含量較少;
　　(2)共培養(yǎng)hMSCs-RPE細(xì)胞的色素含量與RPE細(xì)胞相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)hMSCs-RPE細(xì)胞內(nèi)色素顆粒含量與共培養(yǎng)hMSCs-RPE細(xì)胞的色素含量相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;
　　(3)透射電鏡觀察見hMSCs-RPE細(xì)胞內(nèi)可見成熟的色素顆粒，細(xì)胞頂端可見典型的微絨毛結(jié)構(gòu);
　　(4)hMSCs-RPE細(xì)胞表達(dá)RPE細(xì)胞特

9、異的基因MITF、OTX2、tyrosinase、RPE65、Bestrophine、PEDF、PMEL17、CRALBP、PAX6和誘導(dǎo)前相比都顯著上調(diào)，且和原代分離的人RPE細(xì)胞的表達(dá)水平相類似;
　　(5)hMSCs-RPE細(xì)胞可表達(dá)RPE細(xì)胞特異的蛋白CRALBP、RPE65和ZO-1;
　　(6)FITC標(biāo)記的POS和hMSCs-RPE細(xì)胞共孵育后，豬RPE細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)均可觀察到綠色熒光，而未誘導(dǎo)的hMSCs內(nèi)

10、未見到綠色熒光;hMSCs-RPE細(xì)胞MERTK蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，αvβ5Integrin的表達(dá)也有所上調(diào)，MERTK抗體封閉掉該受體的功能后，吞噬POS的能力顯著下降;
　　(7)hMSCs-RPE細(xì)胞BDNF和GDNF的分泌量上調(diào)明顯，但仍顯著低于豬RPE細(xì)胞。
　　3、hMSCs來源RPE細(xì)胞對(duì)急、慢性視網(wǎng)膜變性的修復(fù)作用
　　(1)碘酸鈉損傷模型的視網(wǎng)膜HE染色可見后極部RPE細(xì)胞幾乎完全損毀，部分RPE細(xì)胞死

11、亡后殘留的色素團(tuán)塊殘留于Bruch's膜上，上方的感光細(xì)胞層呈波浪形;F-ERG顯示A波和B波的幅值較正常大鼠均顯著降低;
　　(2)碘酸鈉損傷的急性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周、8周視網(wǎng)膜免疫熒光染色共聚焦掃描可見，hMSC來源的RPE細(xì)胞可表達(dá)mitochondrial和CRALBP;
　　(3)碘酸鈉損傷的急性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周、8周F-ERG結(jié)果顯示了hMSCs-RPE細(xì)胞移植后較偽手術(shù)組和移植未誘導(dǎo)分化的

12、hMSC組，A波和B波的波幅明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　(4)碘酸鈉損傷的急性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周和8周視網(wǎng)膜總蛋白的WesternBlot結(jié)果顯示rhodopsin的表達(dá)量在移植hMSCs-RPE細(xì)胞組較偽手術(shù)組和移植hMSC組明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(5)RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周和8周hMSCs-RPE細(xì)胞組較偽手術(shù)組和移植hMSC組大鼠視網(wǎng)膜外核層厚度明顯增厚，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;

13、　　(6)RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周和8周視網(wǎng)膜免疫熒光染色共聚焦掃描可見，hMSC來源的RPE細(xì)胞可表達(dá)mitochondrial和CRALBP，但在8周時(shí)間點(diǎn)移植細(xì)胞存活較4周明顯減少;
　　(7)RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周F-ERG結(jié)果顯示hMSCs-RPE細(xì)胞組較偽手術(shù)組和移植hMSC組，A波和B波的波幅明顯升高，，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;而在移植后8周，各組電生理均呈熄滅型，各組間幅值無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;

14、>　　(8)RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周、8周視網(wǎng)膜總蛋白的WesternBlot結(jié)果顯示，MERTK蛋白的表達(dá)在移植hMSC來源的RPE細(xì)胞組4周為陽性8周時(shí)呈陰性，偽手術(shù)4周、8周均為陰性;
　　(9)RCS慢性視網(wǎng)膜變性模型中，移植后4周和8周視網(wǎng)膜免疫熒光染色共聚焦掃描可見，4周時(shí)RPE65陽性的移植細(xì)胞內(nèi)存在rhodopsin陽性的感光細(xì)胞外節(jié)，而8周時(shí)未見RPE65陽性的移植細(xì)胞內(nèi)存在rhodopsin陽性的

15、感光細(xì)胞外節(jié)。
　　結(jié)論:
　　1、成功分離獲得了hMSCs和豬RPE細(xì)胞，獲得細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞表面標(biāo)志符合hMSCs和豬RPE細(xì)胞的特性;
　　2、通過Transwell構(gòu)建hMSCs和RPE細(xì)胞的體外非接觸共培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)hMSCs向RPE細(xì)胞分化，誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞的體外生物學(xué)特性和功能類似于原代分離的RPE細(xì)胞。
　　3、碘酸鈉尾靜脈注射制造的急性視網(wǎng)膜變性大鼠模型，其視網(wǎng)膜組織和結(jié)構(gòu)改變符合急性視網(wǎng)膜