胸膜肺炎放線桿菌PCR定向突變系統(tǒng)的初步建立及胸膜肺炎放線桿菌OmlA-ELISA檢測方法的建立.pdf

1、失序列與目的基因或ORF兩端的同源序列進行同源重組，通過雙交換來置換目的片段，隨著λ噬菌體Red重組酶、FLP重組酶／FRT系統(tǒng)和結(jié)合轉(zhuǎn)移起始位點oriTRK2在該系統(tǒng)中的應(yīng)用，該系統(tǒng)的重組效率得到了很大的提高。 由于PCR定向突變系統(tǒng)建立的時間不長，所應(yīng)用的領(lǐng)域還不廣泛，目前僅僅在酵母、構(gòu)巢曲霉、沙門氏菌、鏈霉菌和一些大腸桿菌等中建立了該系統(tǒng)，而且還有很多不足之處，本研究就建立在鏈霉菌中的PCR定向突變系統(tǒng)進行了改進：該

2、系統(tǒng)在第一次同源重組時，采用接合轉(zhuǎn)移將構(gòu)建的質(zhì)粒由大腸桿菌ETl2567導(dǎo)入鏈霉菌中，篩選時利用的是鏈霉菌對萘啶酸的抗性進行的，因大腸桿菌ETl2567對萘啶酸沒有抗性。如果應(yīng)用到其它的細菌中，則首先要篩選到一株對萘啶酸有抗性的親本菌株，這就影響了該系統(tǒng)在其它細菌中的應(yīng)用。在胸膜肺炎放線桿菌中建立的PCR定向缺失技術(shù)，對這一步驟做了改進，采用了營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌做接合轉(zhuǎn)移；該系統(tǒng)在第二次同源重組時，由于粘粒上沒有了oriT<,RK2>

3、，便應(yīng)用了原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，這增加了試驗的難度和復(fù)雜程度，在應(yīng)用到其它細菌時更是不便；另外第二次同源重組后是通過對抗性消失的檢測來篩選的，效率不夠高，而且工作量也大，本研究在胸膜肺炎放線桿菌中建立PCR定向缺失技術(shù)，對這些步驟做了改進，結(jié)合轉(zhuǎn)移技術(shù)替代了原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，用負向選擇方法取代了原來的篩選方法。通過上述改進，提高了該系統(tǒng)的應(yīng)用范圍。 1.利用PCR定向突變系統(tǒng)研究毒素Ⅳ的ORFl的基因的功能 ApxⅣ為最近發(fā)

4、現(xiàn)的外毒素，由apxⅣA基因編碼并由所有血清型胸膜肺炎放線桿菌菌株產(chǎn)生并分泌。ApxⅣ為體內(nèi)誘導(dǎo)的毒素，體外培養(yǎng)檢測不到ApxⅣ的產(chǎn)生。ApxⅣ在致病中的作用尚不清楚，因為缺失ApxI、Apx II、AvxlII但仍能產(chǎn)生ApxⅣ的菌株不能引起病變或發(fā)病。AoxⅣ目前仍沒證實ApxⅣ是否與其它三種毒素一樣需要激活基因(ORFl)編碼的蛋白的加工。但ApxⅣA基因單獨在大腸桿菌中表達時沒有溶血活性，只有與ORFl共表達時才有很弱的溶血活性

5、。App血清型1的ORFl有474個堿基組成共編碼157個氨基酸，ORFl蛋白的分子量推算約為18 KDa，理論的等電點pI為6.15，ORFl的起始密碼子ATG前7個堿基處有一個被推測為核糖體結(jié)合位點的序列。此前還有類似于．35和一10的啟動子序列和一個徑環(huán)結(jié)構(gòu)。ORFl跟任何已知的蛋白都沒有相似性，但ORFl的具體功能是什么?對胸膜肺炎放線桿菌到底有什么作用還不清楚。 為了研究毒素Ⅳ的ORFl的功能，檢測在胸膜肺炎放線桿菌中

6、建立PCR定向缺失技術(shù)的實用性，本研究提取了胸膜肺炎放線桿菌血清型7的基因組，克隆包括ORFl在內(nèi)的基因組上一個5kb的片段，首先在體外利用λ噬菌體Red重組酶將PCR擴增的含有阿伯拉抗性基因和蔗糖敏感基因的模板取代了胸膜肺炎放線桿菌的毒素Ⅳ的ORFl，然后借助結(jié)合轉(zhuǎn)移系統(tǒng)將不含有ORFl片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入胸膜肺炎放線桿菌，經(jīng)同源重組中斷盒取代了基因組上的ORF1，為進一步研究毒素Ⅳ的ORF1的功能打下了基礎(chǔ)。 2．鏈球菌、副豬嗜血

7、桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、變形桿菌和大腸桿菌對胸膜肺炎放線桿菌血清學檢測的影響 為了檢測臨床上鏈球菌、副豬嗜血桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、變形桿菌及大腸桿菌對胸膜肺炎放線桿菌血清學檢測的干擾，本研究用鏈球菌、副豬嗜血桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、變形桿菌、大腸桿菌及兩株胸膜肺炎放線桿菌地方株胸膜肺炎放線桿菌廣州0403株、胸膜肺炎放線桿菌XT0404株制備免疫原，免疫新西蘭大白兔，采集抗血清，并分別用鹽水法、酚水法和超聲波法制備的胸膜

8、肺炎放線桿菌標準抗原進行檢測。結(jié)果顯示鏈球菌、副豬嗜血桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、變形桿菌及大腸桿菌的抗血清與胸膜肺炎放線桿菌的部分血清型的標準抗原有交叉反應(yīng)。鏈球菌、副豬嗜血桿菌、變形桿菌和大腸桿菌的抗血清對胸膜肺炎放線桿菌ApxⅡ毒素蛋白ELISA診斷方法有干擾作用。本研究初步解釋了胸膜肺炎放線桿菌臨床檢測時高陽性率與胸膜肺炎放線桿菌從病料中的低分離率不一致及血清學檢測假陽性的問題，證實了臨床上的鏈球菌、副豬嗜血桿菌、變形桿菌及大腸桿

9、菌對胸膜肺炎放線桿菌檢測的干擾，為進一步改進目前的檢測方法打下了基礎(chǔ)。 3．胸膜肺炎放線桿菌ELISA檢測方法的建立 為了降低臨床上鏈球菌、副豬嗜血桿菌、變形桿菌及大腸桿菌對胸膜肺炎放線桿菌檢測的干擾，本研究克隆并表達了胸膜肺炎放線桿菌的外膜脂蛋白OmlA基因，用純化的外膜脂蛋白包被ELISA板，經(jīng)過條件的優(yōu)化，初步建立了基于融合表達的外膜脂蛋白上的ELISA檢測方法，并研究了該檢測方法的特異性、穩(wěn)定性及敏感性，還比和向