重配制備甲型流感病毒Vero細(xì)胞高產(chǎn)株及無血清微載體培養(yǎng)流感病毒的研究.pdf

1、流行性感冒簡(jiǎn)稱流感,是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病,能引起心肌炎、肺炎、支氣管炎等多種并發(fā)癥。接種疫苗是預(yù)防流感最有效的手段,流感疫苗以雞胚為生產(chǎn)基質(zhì),有很多弊端,例如,難于在短時(shí)間內(nèi)提供足夠的雞胚進(jìn)行流感疫苗生產(chǎn)以應(yīng)對(duì)流感爆發(fā)的需求。而以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為生產(chǎn)基質(zhì)具有很大的優(yōu)勢(shì),可采用發(fā)酵罐進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn),易于質(zhì)量控制。
　　 Vero細(xì)胞是WHO推薦用于人用疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì),能夠利用生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng),在流感疫苗生

2、產(chǎn)上有著廣闊的應(yīng)用前景。然而在Vero細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒的過程中,因此需要在培養(yǎng)液中添加胰酶,常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)殘留的血清會(huì)導(dǎo)致胰酶失活。采用無血清培養(yǎng)細(xì)胞,可克服所含血清成分對(duì)病毒培養(yǎng)的干擾,還可消除培養(yǎng)時(shí)潛在污染源并利于分離純化。微載體培養(yǎng)細(xì)胞提高了細(xì)胞和病毒的產(chǎn)量,使大規(guī)模培養(yǎng)成為了可能。本實(shí)驗(yàn)采用傳統(tǒng)的流感病毒重配方法,獲得含有疫苗株的表面抗原HA和NA基因且在Vero細(xì)胞上高產(chǎn)的毒株,在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳30代,觀察其傳代穩(wěn)定性,

3、并進(jìn)行無血清微載體培養(yǎng),為今后進(jìn)行細(xì)胞流感疫苗打下基礎(chǔ)。
　　 本課題研究包括以下兩部分內(nèi)容:
　　 一、重配制備甲型流感病毒H1N1 Vero細(xì)胞高產(chǎn)株及傳代穩(wěn)定性
　　 以流感病毒Vero細(xì)胞高產(chǎn)株A/Yunnan/1/2005va(H3N2)為母本株,與WHO推薦的2007～2008年疫苗株A/Solomon Islands/3/2006(H1N1)共同感染Vero細(xì)胞,用抗A/Yunnan/1/2005v

4、a(H3N2)血清篩選重配病毒,并經(jīng)蝕斑純化獲得A/SolomnIslands/3/2006va(H1N1)。在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳10代建立工作種子批,通過基因測(cè)序,血凝抑制試驗(yàn),免疫熒光試驗(yàn),單向免疫瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)證明重配病毒含有A/Solomon Islands/3/2006毒株表面抗原HA和NA的基因。
　　 在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代至30代,分別收獲5代,10代,15代,20代,25代和30代的病毒,采用RT-PCR法擴(kuò)

5、增出重配流感病毒的HA和NA基因片段并測(cè)序,通過BioEdit軟件進(jìn)行基因序列比對(duì)分析,其HA和NA片段與A/SolomonIslands/3/2006(H1N1)同源性達(dá)到了100％。
　　 重配獲得的流感病毒H1N1 Vero細(xì)胞高產(chǎn)株即為A/SolomonIslands/3/2006va(H1N1),能夠在Vero細(xì)胞上高產(chǎn),且連續(xù)傳代穩(wěn)定性良好。
　　 二、無血清微載體培養(yǎng)甲型流感病毒條件的優(yōu)化
　　 首

6、先采用不同的細(xì)胞接種量在無血清微載體中片培養(yǎng)Vero細(xì)胞,選擇適宜的細(xì)胞濃度。之后檢測(cè)不同pH值,TPCK-胰酶含量,不同病毒接種量,補(bǔ)加TPCK-胰酶,以及不同收毒時(shí)間和收毒體積對(duì)血凝效價(jià)的影響。
　　 確定適宜的細(xì)胞接種濃度后,獲得優(yōu)化的無血清微載體培養(yǎng)甲型流感病毒條件:病毒培養(yǎng)液pH值為7.2～7.4范圍內(nèi),TPCK胰酶含量為1.0μg/ml,接種后48h補(bǔ)加胰酶,病毒接種量MOI=1.0,并在72h一并收獲全部培養(yǎng)體積的