飽和脂肪酸在小膠質(zhì)細胞激活中的作用及機制研究.pdf

1、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病如阿爾茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)、帕金森病(Parkinson's disease，PD)、多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis，MS)和艾滋病癡呆復(fù)合征(the AIDS dementia complex)是常見的老年神經(jīng)變性疾病，病因十分復(fù)雜。目前多數(shù)學者認為：神經(jīng)膠質(zhì)細胞活化引起腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)可能是神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病發(fā)病的核心病理機制之一，小膠質(zhì)細胞則是其最主要的炎癥

2、細胞。
　　 小膠質(zhì)細胞是正常中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中重要的免疫細胞。小膠質(zhì)細胞主要呈分枝樣或阿米巴樣兩種形狀，不同的形態(tài)代表不同的功能狀態(tài)：前者代表靜息狀態(tài)；后者代表激活狀態(tài)。正常成熟CNS中的小膠質(zhì)細胞是靜息的分枝狀細胞，缺乏吞噬能力，但具有吞飲功能和一定的遷移能力，可清除代謝產(chǎn)物，起到“清道夫”的作用。靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞通過分泌生長因子促進神經(jīng)元的存活，并調(diào)節(jié)內(nèi)源性免疫系統(tǒng)。

3、另外，小膠質(zhì)細胞可以清除神經(jīng)元正常重塑過程中產(chǎn)生的細胞碎片，有利于神經(jīng)元的發(fā)育存活。然而，當CNS遭受損傷，如炎癥、外傷，小膠質(zhì)細胞可被激活，表現(xiàn)為胞體增大，細胞表面的突起緊縮，變短，增粗，從而由分枝狀的靜息小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變成無突起的激活的阿米巴樣巨噬細胞，這些形態(tài)改變有利于小膠質(zhì)細胞的阿米巴樣運動及發(fā)揮其吞噬功能。靜息狀態(tài)下小膠質(zhì)細胞不表達或只是微弱地表達主要組織相容性抗原(major histocompatibility comple

4、x class，MHC)Ⅰ，如酪氨酸磷酸酶(CD)-45(即白細胞共同抗原)、CD-14、及CD11b/CD18(Mac-1)。激活的小膠質(zhì)細胞增加了細胞MHCⅡ抗原的表達，研究表明AD及PD患者腦中MHCⅡ類抗原表達明顯增加。
　　 在多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病中，如AD、PD及MS，小膠質(zhì)細胞過度激活以及所釋放的具有神經(jīng)毒性的炎癥介質(zhì)可引起神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞死亡?；罨男∧z質(zhì)細胞產(chǎn)生多種免疫效應(yīng)分子，如白介素(interleuki

5、n，IL)-1、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β、前列腺素、趨化因子、分泌蛋白酶、氧自由基(reactive oxygen species，ROS)、一氧化碳(nitric oxide，NO)和興奮性氨基酸等，從而引起局部或廣泛CNS的損傷。這些免疫效應(yīng)分子可通過不同的途徑作用于膠質(zhì)細胞或神經(jīng)元促進其他炎癥分子的產(chǎn)生；它們之間也相互影響、相互促進，引起神經(jīng)元

6、退行性變、局部的小膠質(zhì)細胞激活及炎癥參與的神經(jīng)元退行性變的持續(xù)發(fā)展。
　　 近年來越來越多的研究表明飽和脂肪酸在AD發(fā)病中起重要作用。其中流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)富含飽和脂肪酸飲食是AD發(fā)病的危險因素之一。例如一項21年的追蹤研究表明進食富含飽和脂肪酸的奶制品與中年后的認知和記憶損害有密切關(guān)系。其他研究也證明飽和脂肪酸飲食越多，中老年人的認知損害風險也越高。同時動物實驗亦證實，飽和脂肪酸飲食能夠促使嚙齒類動物大腦發(fā)生與人AD類似的病理學

7、變化以及學習和記憶功能的損傷。
　　 脂肪酸可自由通過血腦屏障，因此，大腦內(nèi)脂肪酸的穩(wěn)態(tài)維持依賴于外周脂肪酸濃度。富含飽和脂肪酸飲食能夠促使更多的自由脂肪酸通過血腦屏障進入大腦。研究表明某些患有以飽和脂肪酸升高為特征的疾病(如心血管疾病、肥胖、Ⅱ型糖尿病及高血壓等)的人群罹患AD的幾率遠高于其他人群。另外，AD患者腦內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)含有較高的軟脂酸(棕櫚酸，plamitic acid，PA)和硬脂酸(stearic acid，S

8、A)，而其大腦白質(zhì)中富含飽和脂肪酸。以上研究均提示飽和脂肪酸和AD兩者之間關(guān)系密切。
　　 近年來研究表明在飽和脂肪酸-PA和SA能促進大鼠腦神經(jīng)元tau蛋白的磷酸化，上調(diào)β-分泌酶的活性。其機制可能是通過星形膠質(zhì)細胞介導的，即促進星形膠質(zhì)細胞過度合成神經(jīng)酰胺所致。體外實驗證實脂肪酸能夠刺激tau蛋白和β-粉樣蛋白的合成。但是PA不能使體外培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)元發(fā)生炎癥反應(yīng)，也無法誘導胰島素抵抗，這表明飽和脂肪酸誘發(fā)AD患者的中樞炎

9、癥可能是通過非神經(jīng)元細胞引起的。
　　 目前，關(guān)于飽和脂肪酸是否激活小膠質(zhì)細胞，及對神經(jīng)元功能的影響的尚不清楚。本課題以原代小膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞系BV-2為主要體外模型，應(yīng)用western blot、免疫熒光、RT-PCR和酶聯(lián)吸附免疫測定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)方法等研究飽和脂肪酸-PA及SA刺激細胞釋放炎癥介質(zhì)及其mRNA的時間和劑量效應(yīng)關(guān)系，明確飽和脂肪酸是否具有激

10、活小膠質(zhì)細胞的作用，并檢測Toll-like receptor(TLR)4/nuclear factorκB(NF-κB)在飽和脂肪酸活化小膠質(zhì)細胞中的作用，以并初步探討飽和脂肪酸通過激活小膠質(zhì)細胞誘發(fā)大腦神經(jīng)元損傷的機制。
　　 一、飽和脂肪酸在小膠質(zhì)細胞激活中的作用
　　 加入10％胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)的dulbecco’smodifiedeagle’smedium(DMEM)培養(yǎng)

11、基，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)BV-2細胞。培養(yǎng)原代小膠質(zhì)細胞：取出生1-2 d的BALB/c小鼠，無菌條件下取腦，剔除軟腦膜及血管，快速切碎組織，胰蛋白酶37℃消化20 min，1000 rpm/min離心5 min，棄上清，加入10％FBS DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，接種至60 mm培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)14 d。其中每3 d換1次液。14 d后，用37℃恒溫振蕩器振蕩(500 rpm/min)2

12、h，收集懸浮細胞，1000 rpm/min離心5 min，棄上清，種植密度1×106/ml。連續(xù)培養(yǎng)10 d，經(jīng)過CD11b免疫熒光鑒定，其純度可達97％，可以用于后續(xù)實驗研究；等細胞密度達到75％～80％后開始試驗，使用前用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基孵育細胞，1 h后加入含PA、SA或拮抗劑的無FBS的培養(yǎng)基孵育細胞進行實驗。因為飽和脂肪酸不溶于水，所以我們首先溶解脂肪酸，將PA和SA溶解在無水乙醇中，制備為200 mM的儲存液。取實驗所需適

13、量濃度加至含有無脂肪酸低內(nèi)毒素BSA的不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基，在其中脂肪酸：BSA的molar：molar為10:1，50℃孵育6 h，此時的脂肪酸與BSA結(jié)合，從而確保脂肪酸的濃度。為避免內(nèi)毒素(lipopoly-saccharide，LPS)對飽和脂肪酸的污染作用，我們用顯色基質(zhì)鱟試劑法檢測配置好PA及SA細菌內(nèi)毒素的含量，結(jié)果顯示100μM PA和100μM SA內(nèi)毒素含量≤3.45x10-3pg/ml(1.77×10-5EU

14、/ml)，此劑量在本實驗中不能激活小膠質(zhì)細胞。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為有顯著性差異。
　　 我們用3-(4，5-二甲基噻唑)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT]法檢測飽和脂肪酸-PA和SA對原代小膠質(zhì)細胞和BV-

15、2細胞活性的影響。結(jié)果顯示在BV-2細胞中，PA在25μM(94.78±4.34％)、50μM(101.09±14.61％)、和100μM(89.49±6.51％)與對照相比(100.08±5％)無明顯差異(P>0.05)，提示25-100μM PA無細胞毒性。而200μM PA(66.82±4.91％)明顯誘發(fā)細胞死亡(P<0.05)。另外MTT結(jié)果顯示，在BV-2細胞中25-100μM SA無細胞毒性；而在原代小膠質(zhì)細胞中，25-1

16、00μM PA顯示無細胞毒性。因此我們選取25-100μM PA或SA作為后續(xù)實驗劑量。同時PA是機體循環(huán)系統(tǒng)中含量最多的飽和脂肪酸，我們選取PA作為飽和脂肪酸激活小膠質(zhì)細胞的機制研究的代表。
　　 小膠質(zhì)細胞激活伴隨細胞形態(tài)和細胞膜表面抗原的改變，因此我們首先檢測PA孵育對小膠質(zhì)細胞細胞形態(tài)和CD11b表達的影響。在100μM PA孵育6 h和24 h后，BV-2細胞和原代小膠質(zhì)細胞胞體增大，細胞表面的突起變短，從而由分枝狀的

17、靜息小膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變成無突起/或突起較短的激活的阿米巴樣細胞。100μM PA或LPS(500 ng/ml陽性對照)孵育24 h后，細胞膜表面CD11b表達明顯增加，進一步提示飽和脂肪酸可激活小膠質(zhì)細胞。
　　 小膠質(zhì)細胞激活后釋放大量的炎癥介質(zhì)，后者導致神經(jīng)元損傷和調(diào)亡。我們接下來觀察PA對小膠質(zhì)細胞釋放炎癥介質(zhì)的影響。實驗分為三組：對照組，PA處理組和LPS處理組。RT-PCR結(jié)果顯示，用25-100μM PA或500 ng/

18、ml LPS孵育BV-2細胞4 h后，PA和LPS上調(diào)TNF-α、IL-1β及IL-6 mRNA的表達。另外，用25-100μM PA孵育BV-2細胞12 h、24h及48 h后，500 ng/ml LPS孵育24 h作為陽性對照，收集細胞培養(yǎng)基，利用ELISA檢測炎癥細胞因子水平。結(jié)果顯示PA呈劑量依賴性和時間依賴性刺激小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α、IL-1β及IL-6。而這種刺激效應(yīng)在PA濃度為100μM，孵育24 h時呈現(xiàn)出最大刺激效

19、應(yīng)，故本研究選擇100μM作為最佳刺激濃度，24 h作為最佳刺激時間。100μM PA在24 h誘發(fā)小膠質(zhì)細胞釋放IL-1β(409.47±54.54 pg/ml)明顯高于陽性對照LPS(306.93±45.10 pg/ml)，而100μM PA在24 h誘發(fā)小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α(344.06±18.38 pg/ml)和IL-6(65.19±8.49 pg/ml)明顯低于陽性對照LPS組(TNF-α，451.14±40.95 pg/

20、ml；IL-6，209.88±22.60 pg/ml)。
　　 被激活的小膠質(zhì)細胞不僅有形態(tài)學上的改變，激活的小膠質(zhì)細胞也活化了誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)，NO產(chǎn)物增加，還原代謝產(chǎn)物降低，導致神經(jīng)元損傷和調(diào)亡。NO的合成主要受NOS的調(diào)節(jié)，接下來我們檢測PA對小膠質(zhì)細胞釋放NO和iNOS表達的影響。實驗分為三組：對照組，PA處理組和LPS處理組。用25-100μ

21、M PA孵育BV-2細胞12 h、24 h及48 h后，LPS(500 ng/ml)孵育24 h作為陽性對照，收集細胞培養(yǎng)基，檢測NO的水平。結(jié)果顯示，PA呈劑量依賴性和時間依賴性刺激BV-2細胞釋放NO。100μM PA在24 h誘發(fā)小膠質(zhì)細胞釋放NO(9.44±1.07μM)明顯高于對照組(2.58±0.42μM)，而低于陽性對照LPS組(14.11±2.13μM)。RT-PCR結(jié)果顯示，25.100μM PA或500 ng/ml

22、LPS孵育BV-2細胞4 h后，iNOS mRNA明顯增加。免疫熒光標和westem blot結(jié)果顯示，25-100μM PA孵育BV-2細胞24 h，上調(diào)iNOS的表達。同時，與對照組(0.00±0.00)相比，PA呈濃度依賴性上調(diào)iNOS水平，表達分別為25μM(0.242±0.063)、50μM(0.598±0.049)、100μM(0.649±0.048)；而100μM PA處理組iNOS的表達高于陽性對照LPS組(0.503±

23、0.085)。另外，免疫熒光標檢測結(jié)果表明，加入PA(100μM)或LPS(500 ng/ml)6 h后，BV-2細胞和原代小膠質(zhì)細胞膜上iNOS表達增加；而PA或LPS孵育24h后，iNOS表達增加更明顯。結(jié)果提示PA可能通過上調(diào)小膠質(zhì)細胞中iNOS的表達誘發(fā)NO的釋放。
　　 目前認為ROS的過量表達是AD、PD及MS等神經(jīng)退行性疾病最終的共同發(fā)病機制，其主要來源于活化的小膠質(zhì)細胞及功能受損的線粒體。接下來我們檢測PA對小膠

24、質(zhì)細胞釋放ROS的影響。我們用100μM PA孵育BV-2細胞12 h和24 h后，500ng/mL LPS孵育24 h作為陽性對照，用PBS充分沖洗后，加入10μMH2DCFDA or2μM DHE孵育60 min后，收集培養(yǎng)基，分別檢測過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)和超氧(superoxide，O2-)。結(jié)果顯示，PA或LPS孵育24 h后，顯著誘導BV-2細胞生成ROS。與對照組(1.01±0.04)相比

25、，100μM PA(5.88±0.65)在24 h顯著促進H2O2的釋放，而低于陽性對照LPS組(7.25±0.19)。同時，與對照組(1.00±0.04)相比，100μM PA(4.59±0.28)在24 h顯著促進O2-的釋放，接近陽性對照LPS組(4.44±0.67)。
　　 為了檢測飽和脂肪酸對小膠質(zhì)細胞的作用具有普遍性，我們用另一種飽和脂肪酸-SA孵育細胞4 h，收集細胞RNA，利用RT-RCR檢測TNF-α、IL-1

26、β、IL-6和iNOS mRNA的表達。結(jié)果顯示，100μM SA孵育BV-2細胞4小時后，上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6及iNOS mRNA表達。以上結(jié)果提示飽和脂肪酸可誘導小膠質(zhì)細胞的活化并釋放大量的炎癥反應(yīng)因子。
　　 二、飽和脂肪酸激活小膠質(zhì)細胞的作用機制
　　 在第一部分中我們發(fā)現(xiàn)，飽和脂肪酸激活小膠質(zhì)細胞，引起炎癥介質(zhì)的釋放，哪么PA活化小膠質(zhì)細胞的分子機制是什么?有關(guān)文獻報道飽和脂肪酸激活巨噬細胞NF

27、-κB，NF-κB是iNOS、環(huán)氧化酶-2、TNF-α、IL-1β和IL-6等基因表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，因此我們接下來檢測飽和脂肪酸是否可以激活小膠質(zhì)細胞NF-κB。免疫熒光檢測檢測結(jié)果顯示，100μM PA及500ng/mL LPS孵育1 h后，細胞核NF-κB p65蛋白增強，而胞漿內(nèi)的量逐漸減少，核易位現(xiàn)象明顯。Westem blot結(jié)果顯示，與對照組(0.010±0.04)相比，PA呈濃度依賴性上調(diào)磷酸化NF-κp65水平，表達分

28、別為25μM(0.202±0.028)、50μM(0.342±0.066)、100μM(0.456±0.66)；而低于陽性對照LPS組(0.478±0.042)。另外熒光素酶報告基因檢測顯示，PA孵育24 h后明顯增加NF-κB啟動子活性。與對照組(1.00±0.09)相比，PA呈濃度依賴性增加NF-κB啟動子活性，表達分別為25μM(1.70±0.31)、50μM(2.78±0.43)、100μM(4.06±0.64)；而低于陽性對照

29、LPS組(6.03±0.24)。
　　 接下來我們檢測飽和脂肪酸激活小膠質(zhì)細胞釋放TNFa、IL-1β、IL-6及NO是否依賴NF-κB。實驗分為三組：對照組，PA處理組和PA+吡咯烷二硫基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)處理組。RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，100μMPA處理組在4 h明顯上調(diào)TNF-α、IL-1β、IL-6及iNOS mRNA表達，PA+PDTC組TNF-α、I

30、L-1β、IL-6及iNOS mRNA明顯低于PA處理組。同時100μM PA在24 h顯著誘發(fā)小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6及NO，而PA+PDTC組在24 h誘發(fā)小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α、IL-1β和NO明顯低于100μM PA組。與PA(65.19±8.49 pg/ml)單獨作用相比，PA+PDTC組(54.60±10.09pg/ml)并不影響PA誘導IL-6釋放。
　　 有關(guān)文獻報道飽和脂肪酸激活細胞膜上

31、TLR4，進而激活NF-κB。我們利用anti-TLR4 neutralizing抗體(anti-TLR4 Ab)阻斷TLR4后，觀察PA對NF-κB活性的影響。實驗分為三組：對照組，PA處理組和PA+anti-TLR4 Ab處理組。結(jié)果顯示anti-TLR4 Ab顯著抑制PA誘發(fā)的NF-κB p65轉(zhuǎn)位入細胞核。100μMPA在24 h顯著誘發(fā)小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6及NO。而PA+anti-TLR4Ab組在24

32、 h誘發(fā)小膠質(zhì)細胞釋放TNF-α、IL-1β、IL-6(和NO明顯低于100μMPA組。以上結(jié)果提示飽和脂肪酸激活小膠質(zhì)細胞TLR4/NF-κB，引起下游的TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的釋放。
　　 三、飽和脂肪酸激活的小膠質(zhì)細胞誘導神經(jīng)元死亡
　　 從第一、二部分顯示飽和脂肪酸可激活小膠質(zhì)細胞，那么這種作用是否能引起神經(jīng)元的損傷呢?為了驗證此假說，我們首先培養(yǎng)原代神經(jīng)元：取出生1-2天的BALB/c小鼠，無菌

33、條件下取腦，剔除軟腦膜及血管，快速切碎組織，胰蛋白酶37℃消化20 min，1000 r/min離心5 min，棄上清，種植密度1×106。于無血清Neurobasal+B27培養(yǎng)基，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。7 d后，去除無血清Neurobasal+B27培養(yǎng)基，加入來源于飽和脂肪酸處理BV-2的培養(yǎng)基。
　　 BV-2細胞種植于60 mm的培養(yǎng)瓶中，達到75～80％的密度時，用含有25-100μM PA無血清DME

34、M/F12培養(yǎng)基孵育12 h，去除培養(yǎng)基，再加入新鮮無血清DMEM/F12培養(yǎng)基孵育12 h，收集小膠質(zhì)細胞上清液作為神經(jīng)元條件培養(yǎng)基(microglia conditioned medium，PA-CM)。同時收集無PA的小膠質(zhì)細胞上清液作為對照小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基(control CM，control-CM)，然后將收集的條件培養(yǎng)基過濾，儲存在-20℃冰箱備用。將收集的條件培養(yǎng)基加入神經(jīng)元的培養(yǎng)中，觀察細胞的活性及凋亡情況。實驗分為

35、兩組：control-CM處理組和PA-CM處理組。實驗結(jié)果顯示，與control-CM相比，PA-CM孵育48 h可明顯誘發(fā)神經(jīng)元凋亡。為探討小膠質(zhì)細胞條件培養(yǎng)基促進神經(jīng)元凋亡的機制，我們檢測了Bcl-2、Bax和Caspase3的表達，RT-PCR結(jié)果顯示，用25-100μM PA-CM孵育神經(jīng)元24 h后，上調(diào)Bax mRNA的表達，下調(diào)Bcl-2 mRNA的表達，PA-CM處理組Bax/Bcl-2顯著高于control-CM組。

36、Western blot結(jié)果顯示，PA-CM處理組Cleaved caspase3的表達水平明顯高于control-CM組，提示Caspase-3、Bax和Bcl-2共同參與了飽和脂肪酸對神經(jīng)元的促凋亡作用。
　　 本研究顯示飽和脂肪酸可激活小膠質(zhì)細胞，使其有靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變成激活的阿米巴樣細胞；同時引起下游的 TNF-α、IL-1β、IL-6、NO及ROS的釋放；另外，我們發(fā)現(xiàn)飽和脂肪酸可激活小膠質(zhì)細胞的NF-κB，用PDTC特異

37、性阻斷NF-κB后，TNF-α、IL-1β及NO分泌減少；利用TLR4特異性抗體拮抗TLR4后，減弱飽和脂肪酸誘導的NF-κB的激活，同時抑制PA誘導TNF-α、IL-1β、IL-6及NO的分泌；PA激活的小膠質(zhì)細胞能明顯促進神經(jīng)元死亡，并上調(diào)Bax和Caspase-3表達。綜上所述，飽和脂肪酸可激活小膠質(zhì)細胞TLR4/NF-κB信號途徑，引起下游的TNF-α、IL-1β、IL-6及NO等的釋放；這些炎癥介質(zhì)通過調(diào)節(jié)Caspase-3、