犬細(xì)小病毒VP-,2-基因的克隆、表達(dá)與鑒定.pdf

1、犬細(xì)小病毒病是由犬細(xì)小病毒(Canineparvovirus，CPV)感染引起的犬的一種急性傳染病，以劇烈的嘔吐、出血性腸炎和白細(xì)胞顯著減少為主要特征，并可引起犬急性心肌炎。該病發(fā)病急，病程短，傳染性強(qiáng)，死亡率高，是危害我國養(yǎng)犬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 根據(jù)GeneBank已發(fā)表的犬細(xì)小病毒VP2基因序列，設(shè)計一對特異引物，采用SDS-蛋白酶K-酚氯仿抽提法，從犬細(xì)小病毒/犬瘟熱二聯(lián)苗中提取犬細(xì)小病毒的基因

2、組DNA，并以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得了犬細(xì)小病毒VP2基因，將其克隆到質(zhì)粒pET22b(+)的相應(yīng)位點上。重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定和核苷酸序列分析，結(jié)果表明所插入的閱讀框正確，序列無誤，從而成功地構(gòu)建了pET22b/VP2原核表達(dá)載體。 將測序正確的重組質(zhì)粒pET22b/VP2分別轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)和E.coliRosettaTM(DE3)兩種不同宿主菌，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明：重組質(zhì)粒p

3、ET22b/VP2在E.coliBL21(DE3)中未見明顯的目的蛋白表達(dá)帶；而在E.coliRosettTM(DE3)中則獲得了高效表達(dá)，在相應(yīng)位置上(68kd處)可見明顯的目的蛋白表達(dá)帶；重組蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)，且表達(dá)量占菌體總蛋白的30％以上；Ni2+親和層柱純化收集蛋白，純化后的蛋白經(jīng)復(fù)性處理后，能與犬細(xì)小病毒陽性血清發(fā)生特異反應(yīng)。 本試驗成功地克隆了犬細(xì)小病毒VP2基因完整片段，并實現(xiàn)了其在原核表達(dá)系統(tǒng)中的高效