CCL19-CCR7在肺癌A549細(xì)胞中通過Sp1調(diào)控乙酰肝素酶表達(dá).pdf

1、前言
　　 趨化因子(chemokine)CCL19與其受體CCR7在淋巴細(xì)胞的歸巢中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在許多實(shí)體性腫瘤CCR7高表達(dá),并且與腫瘤的生長,血管發(fā)生,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其侵襲相關(guān)。我們課題組前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CCR7在非小細(xì)胞肺癌中過表達(dá),并且與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其侵襲密切相關(guān)。但目前CCL19/CCR7促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的確切機(jī)制尚不清楚。我們在肺癌細(xì)胞中加入CCL19后,發(fā)現(xiàn)Hpa表達(dá)上調(diào)。乙酰肝素酶(hepar

2、anase,Hpa)在轉(zhuǎn)移性的惡性腫瘤細(xì)胞中普遍存在,能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜,促進(jìn)是腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此我們預(yù)測CCL19/CCR7通過調(diào)控Hpa的表達(dá),促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲,但是調(diào)控機(jī)制不清。Hpa基因的啟動(dòng)子區(qū)含有轉(zhuǎn)錄因子Sp1的結(jié)合位點(diǎn)。本研究在肺腺癌A549細(xì)胞中外源性加入CCL19激活CCR7后,研究其對Sp1和Hpa表達(dá)以及細(xì)胞侵襲力的影響。
　　 材料與方法
　　 1、抗體和試劑:多克隆乙酰肝素酶抗體、

3、CCR7抗體、單克隆抗體Sp1抗體、Mithramycin A,CCL19購自peprotech公司。
　　 2、細(xì)胞培養(yǎng):人肺腺癌A549細(xì)胞系用含有10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,37℃,5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　 3、RT-PCR:取對數(shù)生長期的細(xì)胞用TRIZOL(Invitrogen,USA)提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴(kuò)增,1.5％瓊脂糖凝膠電泳,用Image J軟件進(jìn)行表達(dá)強(qiáng)度分析。
　　 4、

4、蛋白印跡分析:收集細(xì)胞,提取總蛋白,60～80微克總蛋白經(jīng)12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。檢測乙酰肝素酶、Sp1水平。
　　 5、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP):按照ChIP試劑盒說明進(jìn)行,檢測Sp1與乙酰肝素酶啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合情況。
　　 6、Transwell試驗(yàn):接種各組細(xì)胞于含有或者不含Matrigel微孔濾膜的小室中,分別培養(yǎng)24h后,4％多聚甲醇固定,蘇木素染色,顯微鏡觀察細(xì)胞體外侵襲和遷

5、移能力變化。
　　 7、統(tǒng)計(jì)分析:使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1、CCL19/CCR7通過Sp1上調(diào)肺癌A549細(xì)胞Hpa的表達(dá)
　　 外源性加入CCL19作用不同時(shí)間后,Sp1和HpamRNA和蛋白的表達(dá)水平上調(diào)。其中Sp1抑制劑MA對Sp1與HpamRNA和蛋白抑制作用明顯,分別用CCR7抗體作用24h,Sp1的抑制劑Mithramyci

6、n A(MA)作用后加入CCL19,RT-PCR和western blot顯示Sp1與Hpa的表達(dá)均下調(diào)。
　　 2、CCL19促進(jìn)了Sp1與Hpa啟動(dòng)子的結(jié)合
　　 我們首先分析了乙酰肝素酶啟動(dòng)子區(qū)的序列,證實(shí)了Sp1與乙酰肝素酶的連接位點(diǎn)(5-GGGGC-3)即GC-box。ChIP分析顯示Sp1與Hpa啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合,在經(jīng)過CCL19處理后增加,CCR7阻斷后有所下降,未受CCL19影響。
　　 3、CCL