Annexin A3在穩(wěn)定培養(yǎng)卵巢癌鉑類耐藥細(xì)胞系中的表達(dá)及其對順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景和目的:
　　 卵巢癌是死亡率最高的婦科惡性腫瘤，雖經(jīng)過規(guī)范化的治療，包括理想的腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和以鉑類和/或紫杉醇為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療，晚期卵巢癌的5年生存率仍徘徊在15％—20％左右[1]，對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是造成卵巢癌5年生存率得不到改善的一個(gè)重要原因。
　　 化療耐藥可分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩種。約有15％—20％的卵巢癌患者對順鉑等化療藥物原發(fā)耐藥。多數(shù)患者在接受化療的過程中逐漸產(chǎn)生耐藥性，臨床表現(xiàn)規(guī)范化療停藥

2、6個(gè)月內(nèi)臨床復(fù)發(fā)、用藥期間出現(xiàn)部分緩解、最好的療效為穩(wěn)定等。腫瘤的耐藥現(xiàn)象一方面與抗腫瘤藥物的反復(fù)作用引起基因的突變或后遺傳性改變有關(guān)，另一方面也有賴于腫瘤中已經(jīng)存在的耐藥細(xì)胞亞群的選擇性生長。
　　 鉑類的耐藥機(jī)制尚未明確，主要涉及以下幾個(gè)方面：1、藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)蓄積減少，包括細(xì)胞對藥物的攝入減少和主動外排增加；2、腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的轉(zhuǎn)化和解毒功能增強(qiáng)；3、腫瘤細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)功能增強(qiáng)；4、鉑類藥物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的過程

3、中，細(xì)胞凋亡傳導(dǎo)通路上的調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)改變等。作為目前臨床治療卵巢癌的一線化療藥物，闡明其耐藥機(jī)制，對逆轉(zhuǎn)臨床耐藥和提高患者5年生存率具有重要的意義。
　　 2003年，本課題組受北京協(xié)和醫(yī)院重點(diǎn)基金資助，開展了卵巢癌耐藥相關(guān)蛋白的比較蛋白質(zhì)組分析、尋找耐藥相關(guān)候選蛋白的研究。在通過體外誘導(dǎo)構(gòu)建卵巢癌SKOV3順鉑耐藥細(xì)胞株，以及獲購卵巢癌順鉑敏感(A2780)、耐藥細(xì)胞株(A2780/CDDP)的基礎(chǔ)上，采用雙向電泳技術(shù)(2—

4、DE)比較卵巢癌順鉑敏感、耐藥細(xì)胞的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，鑒定差異表達(dá)蛋白，篩選獲得目標(biāo)耐藥候選蛋白AnnexinA3。利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建含正義、反義Annexin A3序列的真核表達(dá)質(zhì)粒，人為地上調(diào)或下調(diào)Annexin A3蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證了Annexin A3蛋白與鉑類耐藥的相關(guān)性，進(jìn)而又從動物水平和人體水平進(jìn)一步探討其在體內(nèi)發(fā)揮耐藥功能的可能性。
　　 近期研究表明，細(xì)胞耐藥現(xiàn)象可能與抗癌藥物引起的細(xì)胞凋亡程序缺陷有關(guān)。

5、順鉑能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，控制細(xì)胞凋亡途徑有關(guān)的信號傳導(dǎo)通路、調(diào)節(jié)蛋白的異常表達(dá)可能與細(xì)胞的藥物敏感性相關(guān)。
　　 本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，首先檢測了卵巢癌耐藥細(xì)胞系在體外穩(wěn)定培養(yǎng)過程中耐藥性的維持及Annexin A3蛋白的表達(dá)。采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建含正義和反義Annexin A3序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞系。進(jìn)一步驗(yàn)證AnnexinA3在順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡通路中的可能作用機(jī)制。
　　 研究內(nèi)容及方法:

6、r>　　 1、體外常規(guī)培養(yǎng)卵巢癌順鉑敏感細(xì)胞系SKOV3、A2780，以及耐藥細(xì)胞系SKOV3/CDDP、A2780/CDDP，采用MTT的方法檢測細(xì)胞的耐藥指數(shù)，并從不同時(shí)間復(fù)蘇和持續(xù)培養(yǎng)兩個(gè)不同角度探討耐藥細(xì)胞系耐藥性的維持。比較兩細(xì)胞系細(xì)胞形態(tài)(姬姆薩—瑞氏染色)、生長曲線(7天培養(yǎng)法)、生長周期(流式細(xì)胞儀檢測)等生物學(xué)特性的差異。Western blot鑒定兩細(xì)胞系A(chǔ)nnexin A3蛋白表達(dá)的差異。
　　 2、分別

7、構(gòu)建含正義、反義AnnexinA3序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過PCR、雙酶切、測序后基因比對鑒定重組載體。感染包裝細(xì)胞PT67，轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞測定病毒滴度。轉(zhuǎn)染相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞，篩選陽性克隆，Western blot鑒定細(xì)胞轉(zhuǎn)染后Annexin A3表達(dá)水平的變化。擴(kuò)增轉(zhuǎn)染后經(jīng)篩選鑒定的陽性克隆，MTT法比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的耐藥性。比較轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的形態(tài)(姬姆薩—瑞氏染色)、生長曲線(7天培養(yǎng)法)、生長周期(流式細(xì)胞儀檢測)等生物學(xué)特性

8、的差異。
　　 3、順鉑作用24小時(shí)后，采用流式細(xì)胞儀分別檢測卵巢癌化療敏感、耐藥、以及轉(zhuǎn)染正義、反義AnnexinA3的細(xì)胞凋亡率。以不同濃度的順鉑作用24小時(shí)，Western blot觀察凋亡途徑上的作用蛋白Caspase3、Caspase9、Caspase8及Survivin表達(dá)水平的差異。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、采用MTT法前后間隔5個(gè)月、分別三次測定卵巢癌耐藥細(xì)胞的耐藥指數(shù)。SKOV3/CDDP的

9、耐藥指數(shù)分別為1.844±0.37、2.18±0.19、2.07±0.57，A2780/CDDP的耐藥指數(shù)分別為2.954±0.26、3.24±0.56、2.96±0.58，RI的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。耐藥細(xì)胞持續(xù)培養(yǎng)，在0week、2weeks、4weeks、6weeks、8weeks時(shí)間點(diǎn)檢測細(xì)胞耐藥指數(shù)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。姬姆薩±瑞氏染色結(jié)果顯示：SKOV3/CDDP細(xì)胞多核及畸形核多見，A2780/C

10、DDP部分細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞核改變不明顯。耐藥細(xì)胞的群體倍增時(shí)間延長。耐藥細(xì)胞的細(xì)胞周期中，G0±G1期細(xì)胞比例增加，S、M期細(xì)胞比例減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。耐藥細(xì)胞AnnexinA3表達(dá)水平增高。
　　 2、以正義、反義Annexin A3質(zhì)粒為模板，行PCR增加Xho I酶切位點(diǎn)，瓊脂糖凝膠電泳可見1kb左右預(yù)期條帶。重組病毒載體鑒定：以菌液為模板行PCR、EcoR I、Xho I雙酶切重組載體，瓊脂糖凝膠電泳

11、可見預(yù)期條帶；用通用引物雙向測序，序列拼接后與GenBank內(nèi)anx3基因cDNA比較，序列100％相符。pMSCV—sense anx3病毒滴度平均值=1.55×105CFU/mL，pMSCV—antisense anx3病毒滴度平均值=1.78×105CFU/mL。Western blot驗(yàn)證轉(zhuǎn)染后細(xì)胞AnnexinA3的表達(dá)水平明顯的上調(diào)或下調(diào)。MTT法測定細(xì)胞耐藥指數(shù)，敏感細(xì)胞系在轉(zhuǎn)染。pMSCV—sense anx3后耐藥指數(shù)

12、上升約2—6倍，生長和增殖受到抑制。耐藥細(xì)胞系在轉(zhuǎn)染pMSCV—antisense anx3后耐藥指數(shù)下降約1.2—2.2倍左右，生長和增殖加快。細(xì)胞形態(tài)均無明顯改變。
　　 3、在藥物作用24h后，順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞開始凋亡。其中，耐藥細(xì)胞系的凋亡率明顯低于敏感細(xì)胞系。與卵巢癌化療敏感的細(xì)胞株相比，轉(zhuǎn)染正義AnnexinA3的細(xì)胞凋亡率明顯降低。與卵巢癌化療耐藥的細(xì)胞株相比，轉(zhuǎn)染反義AnnexinA3的細(xì)胞凋亡率明顯增高。卵

13、巢癌耐藥細(xì)胞系在高濃度的順鉑(60ug/ml)作用下，可以觀察到凋亡通路蛋白Caspase8、Caspase9、Caspase3的表達(dá)，Survivin的表達(dá)水平增高。轉(zhuǎn)染反義pMSCV—antisense anx3后，低濃度的順鉑即可誘導(dǎo)Caspase8、Caspase9、Caspase3蛋白的表達(dá)，Survivin的表達(dá)水平則降低。
　　 研究結(jié)論:
　　 1、卵巢癌順鉑敏感及耐藥細(xì)胞系SKOV3和A2780，經(jīng)過長

14、期體外常規(guī)培養(yǎng)、反復(fù)凍存，其耐藥性仍能維持穩(wěn)定。與本課題前期研究的細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞的生物學(xué)特性無明顯的改變。本課題組誘導(dǎo)的SKOV3/CDDP耐藥指數(shù)較三年前有所下降，但仍良好地維持了其順鉑耐藥特性。
　　 2、采用基因工程技術(shù)分別將含正義或反義Annexin A3序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染卵巢癌鉑類敏感和耐藥細(xì)胞后，獲得穩(wěn)定的細(xì)胞克隆。進(jìn)一步驗(yàn)證了AnnexinA3蛋白與鉑類耐藥的相關(guān)性。
　　 3、Annexin A