高血壓大鼠局灶性大腦皮層梗死后同側(cè)丘腦β淀粉樣蛋白沉積與繼發(fā)性損害研究.pdf

1、研究背景：
　　 腦梗死是中老年人常見病、多發(fā)病,具有發(fā)病率高、死亡率高、致殘率高的特點(diǎn),而且發(fā)病率呈上升及年輕化趨勢(shì),嚴(yán)重危及人類健康,給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。隨著神經(jīng)影像技術(shù)的飛速發(fā)展,腦梗死臨床診斷水平有了質(zhì)的飛躍,但治療形勢(shì)仍非常嚴(yán)峻,目前除了超早期溶栓治療的有效性得到肯定之外,仍缺乏其他確實(shí)可靠的臨床特效治療,但溶栓治療受到嚴(yán)格適應(yīng)癥的限制,特別是治療時(shí)間窗的限制,而且溶栓治療也有一定繼發(fā)性出血的風(fēng)險(xiǎn),故真正

2、能從溶栓治療中獲益的腦梗死患者比例非常小。造成腦梗死治療困難,致死、致殘率高的重要因?yàn)橹皇菍?duì)腦梗死病理生理等發(fā)病機(jī)制仍缺乏深入了解。因此,通過研究腦梗死的發(fā)病機(jī)制來探索新的有效治療策略成為腦梗死研究領(lǐng)域的當(dāng)務(wù)之急。
　　 目前,有關(guān)腦梗死方面的研究無論是臨床研究還是基礎(chǔ)研究,都主要集中在如何減輕梗死灶局部的神經(jīng)組織損傷和增強(qiáng)缺血周圍組織的代償能力,從而改善神經(jīng)功能,但對(duì)腦梗死后遠(yuǎn)隔部位的繼發(fā)性損害極少關(guān)注。尸體解剖()動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

3、和神經(jīng)影像學(xué)研究均發(fā)現(xiàn):局灶性大腦皮層梗死后不僅導(dǎo)致相應(yīng)供血區(qū)的腦組織神經(jīng)細(xì)胞死亡,而且對(duì)非缺血的但與原發(fā)病灶有著突觸聯(lián)系的遠(yuǎn)隔部位(例如:丘腦、黑質(zhì)、脊髓等)也可以引起繼發(fā)性損害,并影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。因?yàn)榍鹉X不屬于大腦中動(dòng)脈供血區(qū),大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occulusion,MCAO)后同側(cè)丘腦繼發(fā)性損害是局灶性腦梗死后繼發(fā)性遠(yuǎn)隔損害的典型代表,也是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。腦梗死后遠(yuǎn)隔部位繼發(fā)性損害

4、的具體發(fā)生機(jī)制目前尚未完全闡明。
　　 β淀粉樣蛋白(beta-amyloid,Aβ)是阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)特征性病理改變老年斑的主要成份。Aβ是公認(rèn)的神經(jīng)毒性分子,它在腦內(nèi)異常沉積對(duì)AD發(fā)病起核心作用。Aβ是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)經(jīng)β-和γ-分泌酶水解后產(chǎn)生的,抑制β-或γ-分泌酶均能有效減少Aβ生成。因?yàn)棣?分泌酶是APP水解產(chǎn)生

5、Aβ的最后一步,也是決定Aβ變體長(zhǎng)度的關(guān)鍵,所以γ-分泌酶抑制劑被認(rèn)為是治療AD很有前景的藥物。N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S—phenylglycine t-butyl ester(DAPT)是γ-分泌酶抑制劑的一種,具有高度選擇性,研究發(fā)現(xiàn)口服DAPT能有效降低動(dòng)物血漿、腦脊液及大腦皮質(zhì)或海馬Aβ水平,且呈劑量依賴性,并能顯著改善AD小鼠的認(rèn)知功能。近年來,研究發(fā)現(xiàn)Aβ在腦內(nèi)的異常

6、沉積并非AD所特有,MCAO后不僅梗死灶周邊有Aβ異常沉積,而且同側(cè)丘腦也有Aβ異常沉積現(xiàn)象,但Aβ在丘腦沉積后的作用目前仍不清楚。
　　 建立在易卒中型腎血管性高血壓大鼠(stroke—prone renovascular hypertensiverats,RHRSP)基礎(chǔ)上的電凝法局灶性大腦皮層梗死模型(MCAO)不僅能較好地模擬臨床上腦卒中的高血壓危險(xiǎn)因素,而且高血壓大鼠側(cè)支循環(huán)較正常血壓鼠更差,可復(fù)制出高梗死發(fā)生率的局灶

7、性腦梗死模型。此外,電凝法MCAO模型的梗死灶局限于大腦皮層,不影響后循環(huán)的血供,所以利用該模型來研究MCAO后遠(yuǎn)隔丘腦部位繼發(fā)性損害具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。
　　 研究目的：
　　 本課題分為兩部分:第一部分,在RHRSP基礎(chǔ)上建立MCAO模型,動(dòng)態(tài)觀察Aβ表達(dá)情況,探討MCAO后Aβ表達(dá)的變化規(guī)律:第二部分,利用γ-分泌酶抑制劑(DAPT)進(jìn)行干預(yù),觀察比較干預(yù)組與對(duì)照組之間丘腦Aβ沉積、丘腦繼發(fā)性損害程度以及神經(jīng)功能的差異,

8、探討Aβ異常沉積是否對(duì)丘腦具有損害作用及對(duì)神經(jīng)功能的影響。
　　 材料和方法：
　　 第一部分:高血壓大鼠局灶性大腦皮層梗死后Aβ表達(dá)的動(dòng)態(tài)觀察
　　 選取體重70～90 g雄性SD大鼠70只按雙腎雙夾法復(fù)制成RHRSP模型并監(jiān)測(cè)血壓。RHRSP術(shù)后12 w,選取血壓穩(wěn)定高于180 mmHg,且無明顯腦卒中征象的高血壓大鼠53只,按電凝法成功復(fù)制左側(cè)MCAO模型30只,另隨機(jī)選取18只作為假手術(shù)組,該兩大組又隨機(jī)

9、分為6個(gè)小組,每小組含MCAO組5只,假手術(shù)組3只,分別在MCAO或假手術(shù)后24 h、2 d、3 d、7 d、21 d、28 d處死,其中術(shù)后24 h組用于2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色以明確梗死灶分布,其余時(shí)間點(diǎn)均用于Aβ免疫組織化學(xué)檢查,以及Aβ/NeuN、Aβ/GFAP和Aβ/OX-42免疫熒光雙標(biāo)以觀察Aβ表達(dá)及其與細(xì)胞共定位情況。
　　 第二部分:高血壓大鼠局灶性大腦皮層梗死后同側(cè)丘腦Aβ沉積與繼發(fā)性損害研

10、究
　　 選取體重70～90 g雄性SD大鼠60只按雙腎雙夾法復(fù)制成RHRSP模型并監(jiān)測(cè)血壓。RHRSP術(shù)后12 w,選取血壓穩(wěn)定高于180 mmHg,且無明顯腦卒中征象的高血壓大鼠52只,按電凝法成功復(fù)制左側(cè)MCAO模型36只,隨機(jī)分為MCAO組、溶劑對(duì)照組和DAPT組,每組12只,另隨機(jī)選取12只作為假手術(shù)組。MCAO術(shù)后72 h,DAPT組大鼠經(jīng)一次性灌胃給予DAPT溶液[50 mg/kg,溶劑為5％(體積比)酒精玉米油溶

11、液,總體積為10 ml/kg]；溶劑對(duì)照組大鼠給予等體積不含DAPT的溶劑:MCAO組和假手術(shù)組大鼠不給予任何灌胃處理。MCAO術(shù)后7 d采用粘貼物移除實(shí)驗(yàn)和提高后軀體擺動(dòng)實(shí)驗(yàn)分別對(duì)感覺和運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià),神經(jīng)功能評(píng)價(jià)結(jié)束后分別從每組隨機(jī)選取8只大鼠進(jìn)行灌注取腦冰凍切片,Nissl染色觀測(cè)梗死灶體積和丘腦組織學(xué)變化,免疫組織化學(xué)檢查觀測(cè)丘腦Aβ沉積程度以及丘腦腹后核(ventroposterior nucleus of the thal

12、amus,VPN)NeuN和OX-42免疫陽性細(xì)胞數(shù)；每組剩余的4只大鼠進(jìn)行灌注取丘腦提取總Aβ x-42蛋白用于酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme—linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)丘腦Aβ x-42水平。
　　 除丘腦Aβ免疫陽性面積以中位數(shù)(四分位間距)表示,并采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Kruskal—Wallis test followed by Mann-Whitney U test)進(jìn)行多組間比

13、較外,其余數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,并采用Student-t test進(jìn)行兩組間比較,單因素方差分析(ANOVA followed by Bonferroni test)進(jìn)行多組問比較。此外,對(duì)MCAO術(shù)后7 d同側(cè)丘腦VPN內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量與大鼠的右前肢感覺、運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分或同側(cè)丘腦Aβ免疫陽性面積之間的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0 for windows進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

14、r>　　 結(jié)果：
　　 一、第一部分結(jié)果
　　 1、TTC染色
　　 假手術(shù)組全腦組織均呈紅色著色:MCAO組術(shù)后24 h除左側(cè)額、顳、項(xiàng)區(qū)未著色外其余腦組織呈紅色著色。
　　 2、Aβ免疫組織化學(xué)及Aβ/NeuN、Aβ/GFAP和Aβ/OX-42免疫熒光雙標(biāo)檢查
　　 假手術(shù)組全腦組織在各時(shí)間點(diǎn)均未見Aβ免疫陽性信號(hào)；MCAO組術(shù)后在梗死灶周邊和同側(cè)丘腦均有Aβ表達(dá),并具有以下3個(gè)特點(diǎn):

15、>　　 2.1 Aβ表達(dá)時(shí)間及表達(dá)量變化:在梗死灶周邊:MCAO術(shù)后2 d細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)Aβ免疫強(qiáng)陽性信號(hào)；3 d時(shí)細(xì)胞內(nèi)Aβ免疫陽性信號(hào)有所減弱,細(xì)胞外出現(xiàn)少量Aβ免疫陽性信號(hào)；7 d時(shí)Aβ免疫陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少,細(xì)胞內(nèi)Aβ免疫陽性信號(hào)也進(jìn)一步減弱,但細(xì)胞外Aβ免疫陽性信號(hào)明顯增加；28 d時(shí)Aβ免疫陽性信號(hào)以細(xì)胞內(nèi)為主,細(xì)胞外幾乎消失。在同側(cè)丘腦:MCAO術(shù)后2 d未見Aβ免疫陽性信號(hào),3 d時(shí)出現(xiàn)少量表達(dá),7 d時(shí)表達(dá)量明顯增加,

16、而且一直持續(xù)至28 d。
　　 2.2 Aβ免疫陽性信號(hào)空間分布特點(diǎn):在梗死灶周邊:MCAO術(shù)后2 d免疫熒光雙標(biāo)示Aβ主要分布于神經(jīng)元內(nèi)；3 d至21 d時(shí)Aβ在神經(jīng)元內(nèi)和細(xì)胞外均有分布；28 d時(shí)Aβ主要分布于星型膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。在同側(cè)丘腦:Aβ均分布于VPN區(qū),除了在MCAO術(shù)后28 d時(shí)有少量Aβ分布于小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)之外其余均分布于細(xì)胞外。
　　 2.3 Aβ免疫陽性信號(hào)形態(tài)學(xué)特點(diǎn):在梗死灶周邊細(xì)胞外的Aβ形狀一直呈細(xì)

17、小顆粒狀；而在同側(cè)丘腦7 d內(nèi)也呈細(xì)小顆粒狀,至21 d時(shí)部分仍呈細(xì)小顆粒狀,但部分聚集成小斑塊狀,28 d時(shí)以斑塊狀為主,且斑塊直徑比21 d明顯增大。
　　 二、第二部分結(jié)果
　　 1、血壓
　　 RHRSP術(shù)后12 w大鼠血壓(193.25±9.82 mmHg)明顯高于RHRSP術(shù)前1w的基礎(chǔ)血壓(103.45±11.99 mmHg,P<0.01)。MCAO術(shù)前1 d和MCAO術(shù)后7 d,假手術(shù)組、MCAO

18、組、溶劑對(duì)照組和DAPT組之間血壓均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。
　　 2、神經(jīng)功能評(píng)價(jià)
　　 MCAO術(shù)前假手術(shù)組、MCAO組、溶劑對(duì)照組和DAPT組大鼠雙側(cè)前肢粘貼物平均移除時(shí)間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)；MCAO術(shù)后7 d,MCAO組、溶劑對(duì)照組和DAPT組大鼠右前肢粘貼物平均移除時(shí)間均比假手術(shù)組明顯延長(zhǎng)(分別為:30.3±3.9,27.9±4.4,22.9±4.8,6.4±1.6 s,P均<0.01),

19、但DAPT組明顯比溶劑對(duì)照組更短(P<0.05)。四組大鼠左前肢粘貼物平均移除時(shí)間與術(shù)前相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。MCAO術(shù)前四組大鼠提高后軀體擺動(dòng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)向左右偏轉(zhuǎn)的百分比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)；MCAO術(shù)后7 d,MCAO組、溶劑對(duì)照組和DAPT組大鼠向右側(cè)偏轉(zhuǎn)的百分比均明顯比假手術(shù)組高(分別為:90.6±9.8％,87.5±10.7％,81.9±13.3％,53.8±15.1％,P均<0.01),但DAPT組與

20、溶劑對(duì)照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　 3、Nissl染色
　　 MCAO術(shù)后7 d MCAO組、溶劑對(duì)照組和DAPT組腦梗死體積占對(duì)側(cè)半球的相對(duì)百分比分別為15.64±2.15％,14.69±2.08％和13.08±3.20％,三組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。MCAO術(shù)后7 d MCAO組、溶劑對(duì)照組和DAPT組同側(cè)丘腦VPN完好神經(jīng)元數(shù)量比假手術(shù)組明顯減少(分別為:40.62±5.09,43.13±

21、4.51,52.98±9.95,71.17±4.54個(gè)/400倍視野,P均<0.01),但DAPT組與溶劑對(duì)照組相比完好神經(jīng)元數(shù)量明顯增多(P<0.05)。
　　 4、丘腦Aβ、NeuN、OX-42免疫組織化學(xué)檢查
　　 假手術(shù)組全腦組織未見Aβ免疫陽性信號(hào)。MCAO術(shù)后7 d MCAO組、溶劑對(duì)照組和DAPT組同側(cè)丘腦Aβ免疫陽性面積比假手術(shù)組明顯增加,均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.001),DAPT組與溶劑對(duì)照組相比同

22、側(cè)丘腦Aβ陽性面積降低50.7％(P<0.001)。
　　 MCAO術(shù)后7 d MCAO組、溶劑對(duì)照組和DAPT組同側(cè)丘腦VPN NeuN免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為:37.6±5.2,38.6±4.6,51.1±5.9個(gè)/400倍視野,均明顯少于假手術(shù)組(63.3±6.6個(gè)/400倍視野,P均<0.01),但DAPT組比溶劑對(duì)照組明顯更多(P<0.05)。
　　 MCAO術(shù)后7 d MCAO組、溶劑對(duì)照組和DAPT組同側(cè)

23、丘腦VPN OX-42免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)分別為:79.1±3.3,75.4±5.8,49.7±5.9個(gè)/400倍視野,均明顯多于假手術(shù)組(17.6±2.0個(gè)/400倍視野,P均<0.01),而且OX-42免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞體積較大,突觸明顯增多,呈活化狀態(tài),但DAPT組與溶劑對(duì)照組相比OX-42免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量明顯更少(P<0.05)。
　　 5、丘腦Aβx-42酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)
　　 MCAO術(shù)后7 d MCAO組

24、、溶劑對(duì)照組和DAPT組同側(cè)丘腦Aβx-42水平明顯高于假手術(shù)組(分別為:1017.25±135.15,952.65±154.23,530.73±145.39和22.23±5.65 pg/mg,P均<0.001)。DAPT組與溶劑對(duì)照組相比降低了同側(cè)丘腦Aβ x-42量為41.47％(P<0.001)。
　　 6、相關(guān)分析
　　 MCAO術(shù)后7 d MCAO組、溶劑對(duì)照組和DAPT這三組缺血大鼠同側(cè)丘腦VPN完好神經(jīng)元數(shù)

25、量(Nissl染色)或NeuN免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量(NeuN免疫組織化學(xué)染色)均與對(duì)應(yīng)三組大鼠右前肢粘貼物平均移除時(shí)間呈明顯負(fù)相關(guān)(r分別為-0.872和-0.891,P均<0.001)。同樣,三組缺血大鼠同側(cè)丘腦VPN完好神經(jīng)元數(shù)量或NeuN免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)量均與對(duì)應(yīng)三組大鼠同側(cè)丘腦Aβ免疫陽性面積呈明顯負(fù)相關(guān)(r分別為-0.789和-0.755,P均<0.001)。但是,三組缺血大鼠同側(cè)丘腦VPN神經(jīng)元數(shù)量與右前肢運(yùn)動(dòng)評(píng)分之間無明

26、顯相關(guān)關(guān)系(P均>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、RHRSP大鼠局灶性大腦皮層梗死后梗死周邊和同側(cè)丘腦存在Aβ的動(dòng)態(tài)表達(dá),其中在梗死周邊表達(dá)為一過性,早期表達(dá)于神經(jīng)元內(nèi),然后釋放到細(xì)胞外,后期被膠質(zhì)細(xì)胞吞噬清除；而在同側(cè)丘腦呈持續(xù)性,一直沉積于細(xì)胞外;
　　 2、RHRSP大鼠局灶性大腦皮層梗死后Aβ表達(dá)在梗死周邊與缺血有關(guān),而在同側(cè)丘腦與直接缺血無關(guān)；
　　 3、局灶性大腦皮層梗死后同側(cè)丘腦Aβ沉