NGAL mRNA熒光定量PCR檢測方法的建立及初步評價(jià).pdf

1、目的： 中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）是lipocalin家族的新成員，于1993年在人中性粒細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。近年來眾多研究表明NGAL基因參與若干腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可能是人類的一種重要的癌基因；Goets等的研究還顯示在細(xì)菌入侵機(jī)體后，NGAL可以作為鐵載體介導(dǎo)阻礙細(xì)菌對鐵的捕獲，從而抑制細(xì)菌的生長，是一種重要的細(xì)菌抑制劑；NGAL

2、還參與腎小管上皮發(fā)生的及功能調(diào)控，對急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）等腎臟功能的診斷價(jià)值比傳統(tǒng)的AKI實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)血肌酐更為快速和準(zhǔn)確，是AKI最強(qiáng)有力的預(yù)測因子。因此對NGAL基因的檢測亦顯得尤為重要。本課題研究的目的就是建立NGAL mRNA的熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR）檢測方法，并將此方法應(yīng)用于臨床結(jié)腸癌患者腫瘤組織、癌旁組織及正常組織NGAL

3、mRNA的檢測，初步驗(yàn)證其應(yīng)用價(jià)值。 方法： 1.根據(jù)NGAL基因序列，設(shè)計(jì)并合成PCR引物，將PCR擴(kuò)增的特異片段克隆入T載體，重組質(zhì)粒經(jīng)篩選、鑒定、定量后作為標(biāo)準(zhǔn)品。 2.在上述NGAL擴(kuò)增片段內(nèi)部設(shè)計(jì)FQ-PCR引物，通過正交設(shè)計(jì)方式對PCR引物濃度、退火溫度、SYBRgreenⅠ染料（Mg2+）濃度等PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，從而建立NGALmRNA的檢測方法。 3.將高濃度標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行系列稀釋，

4、用上述優(yōu)化的FQ-PCR方法進(jìn)行檢測，以NGAL拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，循環(huán)閾值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于被測物的絕對定量。 4.對該檢測方法進(jìn)行敏感性、特異性及重復(fù)性等方法學(xué)評價(jià)。 5.將建立的FQ-PCR用于臨床結(jié)腸癌患者腫瘤組織、癌旁組織及正常組織NGALmRNA的檢測，其結(jié)果與普通PCR相比較。 結(jié)果： 1.成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGM-T-NGAL。 2.確立了FQ-PCR最佳反應(yīng)條件：SYBR10

5、×Buffer（withMg2+）2μl、dNTPs0.2mmol/L、上游、下游引物各0.32μmol/ml、SYBRTaqTM1.25μl、ddH2O15.15μl，退火溫度60.0℃。 3.制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為98.9％，無非特異性擴(kuò)增。建立了以NGAL mRNA SYB RgreenⅠ染料技術(shù)為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，其線性檢測范圍為102～109copies/μl；靈敏度為10copies/μl.高拷貝樣品的

6、天間CV為3.57％、批內(nèi)CV為2.95％，低拷貝樣品的天間CV為3，24％、批內(nèi)CV為1.85％；特異性好； 4.對臨床標(biāo)木的檢測結(jié)果與預(yù)期設(shè)想完全相符。腫瘤組織、癌旁組織正常組織的NGAL mRNA水平呈明顯的下降梯度。與普通PCR相比，該檢測方法靈敏度要高約100倍。 結(jié)論： 我們成功構(gòu)建了FQ-PCR檢測體系和NGA LmRNA的定量標(biāo)準(zhǔn)品，其快速、靈敏、特異的特點(diǎn)適合臨床實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。為臨床NGAL m