表征健康鵝群新城疫病毒的分離及生物學(xué)特性研究.pdf

1、新城疫(ND)是由新城疫病毒(NDV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病，曾屢次形成世界范圍的大流行，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大損失。水禽一直被認為是NDV的自然貯存庫，鵝、鴨等能攜帶NDV，但通常不表現(xiàn)任何臨診癥狀，甚至對NDV強毒株具有堅強的抵抗力。但1997年以來，我國華南和華東地區(qū)發(fā)生了由NDV導(dǎo)致的鵝的臨診疾病。雖然各地采取了積極的防制措施，該病仍然逐漸蔓延、流行，成為繼小鵝瘟之后危害養(yǎng)鵝業(yè)的又一主要病毒性疾病。 研究者從歷次發(fā)病

2、的鵝群分離了大量致病性NDV，發(fā)現(xiàn)它們大多為嗜內(nèi)臟速發(fā)型強毒株(VVNDV)，且在基因型分類上屬于一個新的基因亞型-Ⅶd亞型，有關(guān)這些毒株的生物學(xué)特性已經(jīng)有較多研究。然而，對于健康鵝群中NDV的攜帶情況以及所攜帶病毒的生物學(xué)特性則鮮有報道。本研究在2003-2005年期間，從江蘇、安徽、山東三省的表征健康鵝群分離、鑒定了一定數(shù)量的NDV，對其生物學(xué)特性及分子流行病學(xué)特征進行了研究，并結(jié)合本課題組前期的研究成果，對鵝源NDV的來源進行了進

3、一步探討。 1.表征健康鵝群新城疫病毒的分離和鑒定 自江蘇、山東、安徽三省不同地區(qū)的表征健康鵝群采集泄殖腔棉拭子樣品，分離、鑒定NDV。結(jié)果從1108份樣品中分離到11株NDV，并測定了11株病毒的雞胚平均死亡時間(MDT)和1日齡雛雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)(ICPI)。其中，6株病毒(SD/1/03/Go、AH/1/04/Go、JS/1/04/Go、SD/2/04/Go、SD/3/04/Go和SD/4/04/Go)的MDT為

4、110.2-192.0h，ICPI為0.101-0.431，被判定為NDV弱毒株；3株病毒(SD/1/04/Go、SD/6/04/Go和JS/1/05/Go)的MDT為84.8-89.4h，ICPI為0.840-0.966，被判定為NDV中等毒力毒株；兩株病毒(JS/1/03/Go和SD/5/04/Go)的MDT為53.1-54.6h，ICPI為1.780-1.820，被判定為NDV強毒株。 2.鵝源新城疫病毒融合蛋白基因部分片

5、段的克隆及序列分析 用RT-PCR技術(shù)擴增、克隆了上述11株鵝源NDVF基因部分片段，經(jīng)測序獲得F基因5'端(cDNA)前1700nt(全長1705nt)序列，分析測定的序列及由其推導(dǎo)的氨基酸序列。結(jié)果表明，6株病毒(SD/1/03/Go、AH/1/04/Go、JS/1/04/Go、SD/2/04/Go、SD/3/04/Go和SD/4/04/Go)F蛋白裂解位點序列為¨2G-R-Q-G-R-L117，符合典型的NDV弱毒株特征；

6、5株病毒(SD/1/04/Go、SD/6/04/Go、JS/1/05/Go、JS/1/03/Go和SD/5/04/Go)F蛋白裂解位點序列均為112R-R-Q-K-R-F117，符合典型的NDV強毒株特征。 將11株鵝源NDVF基因編碼區(qū)1654bp核苷酸序列與新城疫標準毒株及近年來國內(nèi)外分離的鵝源或雞源NDV相應(yīng)序列進行比較。結(jié)果表明，6個弱毒株和3個中等毒力毒株之間的同源性大于97％，兩株強毒與其他9株病毒的同源性為90.3

7、％-92.1％。根據(jù)核苷酸序列推導(dǎo)出相應(yīng)的551個氨基酸序列，6個弱毒株及3個中等毒力毒株之間的同源性高達97.1％-97.5％，兩株強毒與其他9株病毒的同源性為91.8％-93.5％。近年來國內(nèi)部分雞源分離株與6個弱毒株和3個中等毒力毒株相應(yīng)氨基酸序列的同源性超過96％，而11株病毒與1997年以來國內(nèi)分離到的對鵝具有高度致病性的NDV相應(yīng)序列的同源性最高僅為94.7％。另外，對F蛋白信號肽區(qū)和F蛋白N-未端27個高變氨基酸位點的比較

8、表明，從外表健康鵝分離的11株鵝源NDV，不管是弱毒株、中等毒力毒株還是強毒株，都在相應(yīng)位點上和某些雞源毒株有很高的相似性。 以F基因高變區(qū)374nt片段(第47～420nt)為基礎(chǔ)，用軟件繪制遺傳發(fā)生樹，發(fā)現(xiàn)6個弱毒株靠得很近，與基因Ⅱ型的LaSota株同處1個分支；3個中等毒力毒株與基因Ⅱ型的TexasGB株共同位于另一個分支；兩個強毒株則與近年來分離自發(fā)病鵝群的部分Ⅶd亞型毒株共同形成另一個分支。對F蛋白7個特征性氨基酸位

9、點的比較、分析發(fā)現(xiàn)，6株弱毒及3個中等毒力毒株與LaSota株、F48E8株分別在7個和6個位點具有完全相同的氨基酸殘基；兩個強毒株的前4個位點與從發(fā)病鵝群分離到的致病性NDV一致，后3個位點則與上述6株弱毒及3株中等毒力毒株完全相同。 結(jié)合對F基因第334-1682nt之間3種限制性內(nèi)切酶HinfⅠ、BstOⅠ和RsaⅠ酶切位點的分析結(jié)果和F基因高變區(qū)374nt片段的遺傳發(fā)生樹分析結(jié)果，將6個弱毒株和3個中等毒力毒株歸入基因Ⅱ

10、型，剩余兩個強毒株歸入基因Ⅶ型。 3.鵝源新城疫病毒血凝素—神經(jīng)氨酸酶基因部分片段的克隆及序列分析 自上述11株NDV中選取6株(JS/1/04/Go、JS/1/05/Go、SD/1/04/Go、SD/5/04/Go、SD/6/04/Go和JS/1/03/Go)，用RT-PCR技術(shù)擴增HN基因部分片段，經(jīng)克隆、測序獲得HN基因編碼區(qū)從起始密碼子ATG至終止密碼子TAA共1716nt片段的編碼區(qū)序列，分析測定的序列及由其推

11、導(dǎo)的氨基酸序列，并與近年來流行的鵝源與雞源NDV的相應(yīng)序列進行比較。 結(jié)果表明，本研究測定的6株病毒HN基因的編碼區(qū)長度皆為1716nt，可編碼571個氨基酸。6株鵝源NDVHN基因編碼區(qū)核苷酸同源性為97.1％-99.9％，對應(yīng)的氨基酸同源性為96.2％-99.7％；與NDV標準強毒株F48E8HN基因核苷酸同源性為83.2％-83.9％，對應(yīng)的氨基酸同源性為86.5％-87.6％；與NDV標準弱毒株LaSotaHN基因核苷酸

12、同源性為81.6％-99.9％，對應(yīng)的氨基酸同源性為87.2％-99.7％；與近年來分離的部分致病性鵝源和雞源NDVHN基因核苷酸同源性為94.8％-99.2％和92.9％-98.8％，對應(yīng)的氨基酸同源性為95.1％-99.5％和94.2％-98.6％。 HN蛋白氨基酸序列中，6株病毒均在第119-121、341-343、432-434、481-483及508-510位含有1個糖基化位點，但JS/1/05/Go和SD/1/04/

13、Go兩株病毒在147-149位多1個糖基化位點N-V-T。6株病毒在第123、172、186、196、238、247、251、344、455、461、465、531及542位含有13個半胱氨酸殘基C。與標準毒株LaSota、F48E8及近年報道的鵝源或雞源NDVHN蛋白氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，6株病毒HN蛋白與細胞受體結(jié)合相關(guān)區(qū)域的氨基酸序列與已報道的NDV相近。驗證鵝源NDV在第48、54、77、266、340及384位的6個特征性氨基酸

14、殘基發(fā)現(xiàn)，6株病毒均含有這6個特征性氨基酸殘基，但有3株病毒(JS/1/04/Go、JS/1/05/Go和SD/1/04/Go)在48位的氨基酸殘基為M，與LaSota株相應(yīng)殘基相同。 4.結(jié)論 1)從表征健康鵝群分離到的NDV大部分為弱毒株，小部分為中等毒力毒株甚至是強毒株； 2)從表征健康鵝群分離到的NDV之間具有很高的同源性，且大部分可以歸入基因Ⅱ型，小部分可以歸入基因Ⅶ型； 3)與經(jīng)典的雞源NDV