骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的初步探討.pdf

1、【背景】糖尿病是一種慢性使人衰弱且花費(fèi)昂貴的疾病，它可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥，包括失明及心臟、腎臟等疾病。目前，全世界大約有2億人在經(jīng)受著糖尿病的折磨，而且發(fā)病人數(shù)到2025年為止，將再增長一倍。糖尿病已經(jīng)成為患者和社會的一個沉重負(fù)擔(dān)，而且問題日益嚴(yán)重，特別是在發(fā)展中國家。通過胰腺或胰島移植治療1型糖尿病(IDDM)及部分2型糖尿病(NIDDM)是一個很有吸引力的方法，但供體來源不足及免疫排斥反應(yīng)的存在大大限制了其臨床應(yīng)用。近年來，隨著成體干

2、細(xì)胞及多能干細(xì)胞等概念的提出，通過干細(xì)胞移植治療糖尿病在世界范圍內(nèi)成為一個新的研究熱點(diǎn)。骨髓基質(zhì)細(xì)胞(MSCs)是一種存在于骨髓，具有多向分化潛能的非造血細(xì)胞，易于分離培養(yǎng)擴(kuò)增，遺傳背景穩(wěn)定，由于其取材方便、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)、基因轉(zhuǎn)染效率高、轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定表達(dá)、可自體回輸從而避免了免疫排斥反應(yīng)，被認(rèn)為是細(xì)胞工程和基因工程理想的種子細(xì)胞，而且能克服胚胎干細(xì)胞(ESC)所不能解決的倫理學(xué)問題。研究表明，在一定條件下，MSCs能分化形成多種組織。

3、 【目的】本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)MSCs和胰腺基質(zhì)細(xì)胞，在二者傳代穩(wěn)定后，以胰腺基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)培養(yǎng)MSCs，探討一種在體外條件下將MSCs誘導(dǎo)成為胰島素分泌細(xì)胞(IPCs)的簡便方法。 【方法】1.取健康成年SD大鼠斷髓處死，75％酒精浸泡5min，無菌條件下取出脛骨、股骨，剪去骨骺端，用D-Hanks液沖出骨髓；密度梯度離心法獲得單個核細(xì)胞，以DMEM/F12全培養(yǎng)基(含碳酸氫鈉2.438g/L，胎牛血清100ml/L，

4、青鏈霉素100單位/ml)培養(yǎng)，貼壁法進(jìn)行純化；取P3代生長良好細(xì)胞用于誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)。 2.取健康成年新西蘭兔后肢脛骨結(jié)節(jié)為穿刺點(diǎn)，以20ml一次性注射器(肝素鈉抗凝)進(jìn)行穿刺，抽取骨髓；以密度梯度離心法和氯化銨溶解法分離骨髓單個核細(xì)胞，以DMEM/F12(1：1)全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以貼壁法進(jìn)行MSCs的純化。 3.取未進(jìn)食的新生SD大鼠，斷髓處死后，置75％的酒精中浸泡5min，無菌條件下取出胰腺組織，經(jīng)機(jī)械剪切和酶消

5、化法獲得單個細(xì)胞，以D-Hanks液洗滌2遍后，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12(1：1)全培養(yǎng)基，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時以成年新西蘭兔胰腺基質(zhì)細(xì)胞的分離和培養(yǎng)作對比。取P2～P5代細(xì)胞培養(yǎng)液用于分化誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。 4.以新生SD大鼠胰腺基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液(培養(yǎng)3天)，按1：3比例與DMEM/F12全培養(yǎng)基混合成為混合培養(yǎng)基，用于大鼠及新西蘭兔MSCs的誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)時間5～10天，隔天換液。 5.對誘導(dǎo)培

6、養(yǎng)獲得的細(xì)胞，以雙硫腙化學(xué)染色，胰島素免疫細(xì)胞化學(xué)染色(ICC)及胰島素基因逆轉(zhuǎn)錄PCR等方法進(jìn)行IPCs的鑒定。 【結(jié)果】1.以密度梯度離心法獲得的骨髓單個核細(xì)胞活性好，MSCs貼壁生長良好，呈典型的成纖維細(xì)胞樣外觀，可穩(wěn)定傳代，增殖能力旺盛；貼壁法可有效去除骨髓中其它雜質(zhì)細(xì)胞，傳統(tǒng)的氯化銨溶血法去除紅細(xì)胞，會影響MSCs活性及貼壁增殖能力，密度梯度離心法加貼壁法可達(dá)到良好的分離純化效果，明顯優(yōu)于氯化銨溶解法；肯定了DMEM/

7、F12(1：1)培養(yǎng)系統(tǒng)(加10％胎牛血清及2.438g/L碳酸氫鈉)對MSCs的培養(yǎng)效果。 2.成年SD大鼠胰腺基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)困難，所得細(xì)胞團(tuán)塊多，培養(yǎng)后極少數(shù)細(xì)胞貼壁，但未見到增殖現(xiàn)象，在72h內(nèi)相繼死亡、碎裂；新生鼠胰腺基質(zhì)細(xì)胞易于分離，貼壁增殖迅速，細(xì)胞形態(tài)多樣，主要呈梭形，少數(shù)呈三角形或星形，不貼壁的胰島細(xì)胞及外分泌腺細(xì)胞隨換液去除，傳至P2代以后，細(xì)胞明顯呈島狀生長，仍以梭形、多角形細(xì)胞為主，在細(xì)胞團(tuán)中出現(xiàn)大的圓形

8、及紡錘形細(xì)胞，胞漿顆粒增多，以雙硫腙染色可見島狀細(xì)胞染色呈陽性。 3.大鼠MSCs與兔MSCs經(jīng)大鼠胰腺基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液共培養(yǎng)，誘導(dǎo)分化5～10天后，紡錘樣及大圓形細(xì)胞增多，細(xì)胞內(nèi)粗顆粒增多，經(jīng)雙硫腙化學(xué)染色，部分細(xì)胞呈陽性，經(jīng)胰島素ICC證實(shí)這部分細(xì)胞胞漿存在胰島素，可見胞漿內(nèi)粗顆粒，所得細(xì)胞行胰島素RT-PCR鑒定，表達(dá)胰島素特異性mRNA。 【結(jié)論】1.密度梯度離心法結(jié)合貼壁法能成功的在體外分離培養(yǎng)MSCs，并穩(wěn)定傳

9、代，分離培養(yǎng)MSCs不適宜應(yīng)用氯化銨溶血法；采用機(jī)械剪切法結(jié)合酶消化法，能成功體外分離培養(yǎng)新生鼠胰腺基質(zhì)細(xì)胞，并穩(wěn)定傳至第五代，探索出了一種簡便的胰腺基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)方法，為IPCs培養(yǎng)微環(huán)境的構(gòu)建提供了依據(jù)，并證實(shí)了在胰腺基質(zhì)細(xì)胞內(nèi)存在胰腺干細(xì)胞，可通過傳代培養(yǎng)擴(kuò)增、自身基質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)向IPCs方向分化。 2.大鼠胰腺基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液可誘導(dǎo)鼠MSCs向IPCs方向分化，誘導(dǎo)培養(yǎng)后的細(xì)胞可被胰島細(xì)胞特異性化學(xué)染色試劑雙硫腙染成腥紅色，

10、經(jīng)胰島素ICC及RT-PCR鑒定均顯示細(xì)胞胞漿內(nèi)有胰島素的合成。證實(shí)了局部微環(huán)境的變化，可使MSCs重新編程，向特定細(xì)胞方向分化，實(shí)驗(yàn)所用胰腺基質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)液與既往實(shí)驗(yàn)研究中使用的生長因子作用相同，構(gòu)建了一個細(xì)胞分化生長的微環(huán)境，但胰腺基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液含有更豐富的細(xì)胞因子和細(xì)胞間信號，更容易為MSCs接受和反應(yīng)，而且容易獲得，價格便宜，更適宜研究和應(yīng)用，為相同物種間MSCs向IPCs方向分化提供了依據(jù)。 3.大鼠胰腺基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液