弓形蟲主要表面抗原P30兩個(gè)不同片段的克隆、表達(dá)及應(yīng)用研究.pdf

1、目的:構(gòu)建剛地弓形蟲(簡(jiǎn)稱弓形蟲)主要表面抗原P30基因兩個(gè)不同片段的克隆并進(jìn)行表達(dá),所獲重組蛋白純化后進(jìn)行弓形蟲病診斷的應(yīng)用性研究.方法:根據(jù)弓形蟲P30基因的全長(zhǎng)序列,設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物,用PCR法從弓形蟲RH株基因組DNA中擴(kuò)增出P30基因的兩個(gè)不同片段,分別構(gòu)建T-A克隆,經(jīng)PCR擴(kuò)增及酶切鑒定后測(cè)序,再亞克隆入pMAL-p2質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,于氨芐青霉素LB平板上粗篩陽(yáng)性克隆,再經(jīng)酶切及PCR擴(kuò)增鑒定重組子.將重組子

2、轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),表達(dá)蛋白以westernblot鑒定.用Amylose Resin以親和層析法純化所表達(dá)的蛋白.以弓形蟲RH株感染家兔,用粗抗原和純化重組抗原以ELISA法比較檢測(cè)各種寄生蟲病患者、感染家兔血清及瘧原蟲感染小鼠血清.結(jié)果:1.成功構(gòu)建相應(yīng)的T-A克隆及pMAL-p2亞克隆,經(jīng)誘導(dǎo)、表達(dá)和鑒定,證實(shí)2個(gè)表達(dá)產(chǎn)物均為目的蛋白,其分子量分別為73ku和70ku.2.重組抗原與粗抗原相比,具有相同的敏感性