微生物來(lái)源藥物的篩選、分離及結(jié)構(gòu)表征研究.pdf

1、傳統(tǒng)的活性成分篩選與表征，往往需要進(jìn)行物理化學(xué)方法的分離純化，經(jīng)體內(nèi)體外活性篩選后，由傳統(tǒng)的UV、IR、NMR、MS結(jié)合其他結(jié)構(gòu)表征技術(shù)(如X-衍射、熱分析等)確定活性成分的結(jié)構(gòu)，整個(gè)過(guò)程繁瑣耗時(shí)，工作量巨大，特別是很多活性成分含量極微，穩(wěn)定性較差，要滿足篩選與結(jié)構(gòu)表征所需的樣品量，其工作難度和工作量都是十分巨大的，因此嚴(yán)重影響了篩選的效率和篩選的成果。 本課題采用高通量體外篩選，篩選出能夠生產(chǎn)活性成分的微生物，經(jīng)分離放大培養(yǎng)、

2、色譜純化，得到微量的活性成分，采用NANONMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。課題采用了高通量體外篩選與核磁共振NANO技術(shù)相結(jié)合，提高了活性成分篩選的命中率，大大減少了工作量，同時(shí)NANO技術(shù)的采用不僅減少了結(jié)構(gòu)表征所需樣品量，提高了工作效率，而且使活性成分的結(jié)構(gòu)表征更為準(zhǔn)確，建立了新的天然藥物篩選與結(jié)構(gòu)表征平臺(tái)，此類藥物篩選模式尚未見報(bào)道。 本文在篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑過(guò)程中，分離得到一個(gè)活性化合物N98-1272D，經(jīng)波譜分析確認(rèn)其為一新

3、的開鏈多烯類抗生素。本文首次用NANONMR技術(shù)報(bào)道了N98-1272D的結(jié)構(gòu)，準(zhǔn)確歸屬了1H和13CNMR化學(xué)位移，并確定了其立體構(gòu)型。首次報(bào)道了其對(duì)AchE的抑制活性，對(duì)以后的結(jié)構(gòu)改造和開發(fā)成新藥有很好前景。 本文在篩選免疫抑制劑過(guò)程中，首次從國(guó)產(chǎn)菌株中篩選到免疫抑制劑霉酚酸的產(chǎn)生菌，該產(chǎn)生菌為一新菌種，而且具有目標(biāo)產(chǎn)物純化相對(duì)容易的特點(diǎn)，為今后免疫抑制劑霉酚酸產(chǎn)業(yè)化提供了一條新的途徑。本文首次對(duì)霉酚酸碳?xì)湫盘?hào)進(jìn)行了全指定，

4、為該化合物的研究提出了有益的資料，為此類化合物的結(jié)構(gòu)解析提供了譜學(xué)依據(jù)。 通過(guò)本課題的研究表明，與傳統(tǒng)的篩選方法相比，NANONMR技術(shù)更適用于對(duì)微量活性化合物進(jìn)行藥物篩選工作。 一、微生物來(lái)源的乙酰膽堿酯酶抑制劑N98-1272D的篩選、分離及結(jié)構(gòu)表征研究 目的：建立微生物來(lái)源的乙酰膽堿酯酶(Acetylcholi-nesterase，簡(jiǎn)稱AChE)抑制劑的高通量篩選方法，經(jīng)篩選找到有抑制活性的發(fā)酵液，從中分離

5、純化獲得高純度活性化合物并確定其結(jié)構(gòu)。 方法：1微生物來(lái)源的乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選 從新疆、云南土壤中分離得到的放線菌，經(jīng)斜面轉(zhuǎn)移，培養(yǎng)基發(fā)酵，得到發(fā)酵液，加入等體積95％乙醇抽提，渦旋混合后室溫放置2h，離心(3000rpm，10min)，取上清液在冷凍旋轉(zhuǎn)濃縮儀上蒸去乙醇，水相用1.5ml乙酸乙酯提取，振蕩后靜置，取乙酸乙酯溶液1.2ml，在冷凍旋轉(zhuǎn)濃縮儀上蒸去乙酸乙酯，作為篩選待用樣品。 2微生物來(lái)源乙酰

6、膽堿酯酶抑制劑篩選通過(guò)樣的純化建立乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選模型，將有抑制活性的菌種保藏并大規(guī)模培養(yǎng)，然后對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行乙酸乙酯提取、薄層層析、硅膠柱層析和制備型HPLC分離純化，獲得具有抑制活性的高純度化合物。 3活性化合物結(jié)構(gòu)確定 將獲得的高純度活性化合物進(jìn)行紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、NANONMR測(cè)定，通過(guò)圖譜解析確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：1活性化合物的分離純化 在對(duì)2141株菌株的篩選中，得到一株陽(yáng)性菌

7、N98-1272，培養(yǎng)N98-1272，經(jīng)一系列發(fā)酵過(guò)程后，從鏈霉菌發(fā)酵物中用乙醇分離提取，蒸去乙醇，用乙酸乙酯提取，對(duì)乙酸乙酯提取物進(jìn)行TLC檢測(cè)，經(jīng)硅膠柱層析，對(duì)收集到的組分進(jìn)行活性測(cè)定，活性組分在氯仿：甲醇為10:2時(shí)被洗脫，收集活性組分，經(jīng)Sep-packODS柱層析后，用HPLC制備，流動(dòng)相為乙腈-水溶液(90:10)，流速為6.0ml/min。收集活性峰，濃縮抽干得到的黃色粉末(N98-1272D)2.3mg。 2N

8、98-1272D結(jié)構(gòu)的確定 對(duì)收集的微量活性化合物進(jìn)行UV、IR、FAB-MS、NANONMR測(cè)定，綜合解析后確定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下： 結(jié)論：1本實(shí)驗(yàn)首次基于NANONMR技術(shù)建立了一套微生物來(lái)源乙酰膽堿酯酶抑制劑的高通量篩選方法，使分離純化一次的微量活性樣品即可確定其分子結(jié)構(gòu)，具有方便、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外均未見相同報(bào)道。 2本實(shí)驗(yàn)篩選分離得到一個(gè)活性化合物N98-1272D，該化合物對(duì)乙酰膽堿酯酶的IC50

9、為0.075mg/ml。經(jīng)波譜分析確認(rèn)其為一新的開鏈多烯類抗生素。該類化合物具有抗真菌、抗癌等活性，但對(duì)AchE的抑制活性為首次發(fā)現(xiàn)。 3本文首次準(zhǔn)確歸屬了開鏈多烯類抗生素N98-1272D1H和13CNMR化學(xué)位移及立體構(gòu)型，各相關(guān)質(zhì)子間的偶合常數(shù)與其結(jié)構(gòu)相符合，并且將NMR研究得到的結(jié)果與計(jì)算機(jī)分子模擬的結(jié)構(gòu)相比較，取得了一致結(jié)論。 二、微生物來(lái)源的免疫抑制劑M01-669A的篩選、分離及結(jié)構(gòu)表征 目的：建立

10、微生物來(lái)源的免疫抑制劑的篩選方法，經(jīng)篩選找到有抑制活性的發(fā)酵液，從發(fā)酵液中分離純化獲得高純度活性化合物并確定其結(jié)構(gòu)。 方法： 1微生物來(lái)源的免疫抑制劑的篩選 從新疆、云南土壤中分離得到的放線菌，經(jīng)斜面轉(zhuǎn)移、培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵液加等體積乙醇浸泡，離心，取上清液蒸干乙醇，用乙酸乙酯提取，乙酸乙酯提取物作為篩選用樣品。 2微生物來(lái)源免疫抑制劑篩選通過(guò)樣的純化 建立啤酒酵母基因工程菌免疫抑制劑篩選模型，將有

11、抑制活性的菌種保藏并大規(guī)模培養(yǎng)，然后對(duì)其發(fā)酵液進(jìn)行乙酸乙酯提取、薄層層析、硅膠柱層析和制備型HPLC分離純化，獲得具有抑制活性的高純度化合物。 3活性化合物結(jié)構(gòu)確定 將獲得的高純度活性化合物進(jìn)行紫外光譜、紅外光譜、質(zhì)譜、NANONMR測(cè)定，通過(guò)圖譜解析確定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：1活性化合物的分離純化 通過(guò)篩選2352個(gè)菌株，發(fā)現(xiàn)M01-669的發(fā)酵液具有抑制活性。對(duì)M01-669發(fā)酵液用乙酸乙酯提取，對(duì)乙酸

12、乙酯提取物進(jìn)行TLC檢測(cè)，硅膠為60F254，經(jīng)硅膠柱層析，對(duì)收集到的組分進(jìn)行活性測(cè)定，收集活性組分，活性成分經(jīng)HPLC制備，流動(dòng)相為55％乙腈-水，流速為6.0ml/min，收集活性峰，濃縮干燥得到活性化合物M01-669A2.1mg。@2M01-669A結(jié)構(gòu)的確定 對(duì)收集的微量活性化合物進(jìn)行UV、IR、FAB-LC、NANONMR測(cè)定，綜合解析后確定了其化學(xué)結(jié)構(gòu)如下：ThechemicalstructureofM01-669

13、A 結(jié)論：1本文在對(duì)免疫抑制劑的篩選中，得到一株陽(yáng)性菌M01-669，培養(yǎng)M01-669，得到的發(fā)酵液通過(guò)硅膠層析和HPLC制備，得到活性組份M01-669A，經(jīng)解析證實(shí)與免疫抑制劑霉酚酸結(jié)構(gòu)一致，這是首次從國(guó)產(chǎn)菌株中分離到該化合物。 2M01-669A產(chǎn)生菌為一新菌種，而且具有目標(biāo)產(chǎn)物純化相對(duì)容易的特點(diǎn)，如果通過(guò)對(duì)本研究發(fā)現(xiàn)的霉酚酸產(chǎn)生菌進(jìn)行誘變育種并實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，能夠大大降低免疫抑制劑霉酚酸的生產(chǎn)成本和提高產(chǎn)品質(zhì)量。