超分辨定位成像中的弱光探測方法研究.pdf

1、超分辨定位成像（Super-resolution localization microscopy，或簡稱定位成像）技術(shù)實現(xiàn)了納米量級的空間分辨率，成為生命科學(xué)領(lǐng)域極具潛力的研究工具之一。定位成像本質(zhì)上是依賴單分子成像實現(xiàn)的，然而單分子的熒光信號通常在幾百至幾千個光子，并且要覆蓋多個像素，所以單分子微弱信號的探測是實現(xiàn)定位成像的關(guān)鍵技術(shù)之一。傳統(tǒng)的定位成像通常使用讀出速度較慢（10MHz）的弱光探測器--電子倍增電荷耦合器件（Electr

2、on multiplying charge coupled device,EMCCD），成像通量較小，限制了該技術(shù)在大樣本超分辨成像（如亞突觸水平神經(jīng)回路成像）等方面的應(yīng)用。因此研究適用于定位成像的新型弱光探測方法對提高成像通量是必要的。本文圍繞該問題，建立了一套研究弱光探測器的超分辨定位成像能力的方法。具體內(nèi)容如下：
　　（1）通過表征探測器噪聲和光子傳遞曲線等特性，從弱光探測靈敏度和成像信噪比等方面定量研究不同類型弱光探測器的

3、整體成像性能。結(jié)果表明：(i)在弱光探測靈敏度方面，以Andor iXon897為代表的EMCCD相機在電子倍增工作模式下具有最高靈敏度（最小可探測器限為2 photon），以 Hamamatsu Flash4.0為代表的sCMOS相機的靈敏度稍差（最小可探測限為3 photon）；(ii)在成像信噪比方面， EMCCD相機在極微弱信號強度下（<13 photon/pixel）成像信噪比最高，但是隨著信號強度的增加，sCMOS相機的成像

4、信噪比優(yōu)于EMCCD相機；(iii)sCMOS相機具備并行高速數(shù)據(jù)讀出能力，其讀出速度（以Hamamatsu Flash4.0為例，400MHz）比EMCCD相機（iXon897為10MHz）快四十倍，但是sCMOS相機的成像均勻性較差。綜合以上發(fā)現(xiàn)，sCMOS有望為提高定位成像的成像速度和通量提供新的有效途徑。
　?。?）基于點狀發(fā)光體的重復(fù)成像與定位，發(fā)展了一種通過定量表征探測器的單分子探測和定位能力的實驗方法。結(jié)果表明，該方

5、法對定位精度的測量達到了1nm的精度。進一步利用該方法，首次演示了在超分辨定位成像的典型信號范圍（50-2000 photon/pixel）內(nèi)，商品化sCMOS相機（Hamamatsu Flash4.0）可以表現(xiàn)出優(yōu)于EMCCD（Andor iXon897）的成像性能。此發(fā)現(xiàn)證實sCMOS相機有能力代替常用的EMCCD相機，將定位成像的成像通量提高40倍，為亞突觸水平神經(jīng)回路成像提供了新的探測途徑。
　?。?）基于仿真方法，利用單

6、分子成像模型及固定圖形噪聲模型，系統(tǒng)研究了sCMOS相機的成像不均勻性對單分子定位的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(i)固定圖形噪聲幾乎對定位精度沒有影響，但是會引入一定的定位偏差；(ii)當(dāng)額外增加像素固定圖形噪聲一半強度的列固定圖形噪聲時定位偏差相應(yīng)的只增加了~20％。對Hamamatsu Flash4.0sCMOS相機而言，其像素固定圖形噪聲要高于列固定圖形噪聲~3-5倍。因此，該sCMOS相機的列固定圖形噪聲對單分子定位的影響很難察覺。該結(jié)論