貓ω干擾素（FeIFN-ω）的克隆與表達(dá)及抗病毒活性研究.pdf

1、近年來，貓作為一種寵物在我國發(fā)展十分迅速，其種類和數(shù)量越來越多，但疾病尤其是病毒病嚴(yán)重危害著貓的健康。為推進(jìn)貓基因工程重組干擾素的研究，本文克隆并表達(dá)了貓干擾素-ω(FeIFN-ω)基因，并進(jìn)一步研究了重組FeIFN-ω(rFeIFN-ω)在貓腎上皮細(xì)胞(CRFK)上的生物學(xué)活性，為重組貓ω干擾素的制備和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 以從貓脾中提取的總RNA為模板，通過RT-PCR的方法克隆擴(kuò)增出FeIFN-ω基因，將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物純化回

2、收后，插入pGEM-TEasyVector克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，以含氨芐青酶素(Amp)的LB平板篩選陽性克隆并對陽性重組子進(jìn)行酶切鑒定，測序。然后根據(jù)原核表達(dá)載體pET-His設(shè)計(jì)含BamHⅠ和NheⅠ酶切位點(diǎn)的引物，以FeIFN-ω基因?yàn)槟０?，通過PCR的方法擴(kuò)增出FeIFN-ω成熟肽基因。將空表達(dá)載體pET-His進(jìn)行BamHⅠ和NheⅠ雙酶切，然后將擴(kuò)增的FeIFN-ω成熟肽基因克隆于原核表達(dá)載體pET-Hi

3、s。將重組表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。重組蛋白包涵體經(jīng)離心收集、超聲破碎、變性、洗滌、溶解、純化和復(fù)性后獲得純化的具有活性的rFeIFN-ω。用細(xì)胞病變抑制法(CPEI50)測定rFeIFN-ω在貓腎上皮細(xì)胞系CRFK/VSV的抗病毒活性。 結(jié)果顯示FeIFN-ω基因全長591bp，編碼196個(gè)氨基酸序列，其中1-23位氨基酸為信號肽區(qū)，24-196位氨基酸為成熟蛋白區(qū)。FeIFN-ω成熟肽基因全長519