深低溫冷凍對大鼠髕腱組織內(nèi)肌腱干細胞生物學(xué)特性影響的研究.pdf

1、目的:
　　探究深低溫冷凍處理對大鼠髕腱組織中肌腱干細胞(tendon-derived stem cells，TDSCs)的細胞存活率、細胞活力、細胞早期凋亡率、細胞遷移能力及肌腱相關(guān)基因表達的影響。
　　方法:
　　實驗組將6只4月齡SD大鼠的髕腱組織取出，置入含有冷凍保護液的凍存管中，放入冰箱4℃中2小時，-80℃中過夜，投入液氮中保存一星期后取出進行細胞培養(yǎng)。對照組將相同條件的大鼠髕腱組織取出后不作任何處理直接細

2、胞培養(yǎng)。無菌條件下將兩組髕腱組織用Ⅰ型膠原酶(3mg/ml，Sigma)消化獲得有核細胞，分別用臺盼藍染色檢測有核細胞存活率;結(jié)晶紫染色檢測有核細胞克隆形成能力;同等條件下將細胞培養(yǎng)到第3代(P3)，用AlamarBlue法檢測肌腱干細胞體外增殖能力;AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法檢測細胞早期凋亡狀態(tài);Transwell法檢測細胞遷移能力;實時定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）檢測細胞肌腱相關(guān)基因Col1α1、S

3、cx和Tnmd的mRNA表達。
　　結(jié)果:
　　與對照組相比，經(jīng)深低溫冷凍后的髕腱組織來源的有核細胞存活率下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);實驗組和對照組原代有核細胞中均有細胞克隆的形成，證實均可成功分離培養(yǎng)鑒定出具有克隆形成能力的肌腱干細胞，但髕腱組織經(jīng)深低溫冷凍后肌腱干細胞數(shù)量下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);實驗組及對照組肌腱干細胞(P3)培養(yǎng)14天過程中觀察到細胞增殖活力相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.0

4、5);同時，實驗組和對照組第3代肌腱干細胞早期凋亡率、細胞遷移能力、肌腱分化相關(guān)基因表達量相近，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　深低溫冷凍使大鼠肌腱組織內(nèi)有核細胞的存活率降低，但肌腱組織仍保留大量有活性的干細胞。盡管實驗組中肌腱干細胞的數(shù)量有所下降，但和對照組中肌腱干細胞相比，其細胞增殖能力(P3)、早期凋亡率、體外遷移能力及成肌腱分化能力未見明顯異常。研究可為臨床應(yīng)用深低溫冷凍保存的同種異體肌腱移植修