CFB-siRNA抑制實(shí)驗(yàn)性大鼠脈絡(luò)膜新生血管的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:年齡相關(guān)性黃斑變性(age-relatedmaculardegenerate-on，AMD)是導(dǎo)致55歲以后視力不可逆損害的主要原因之一，其分為干性AMD和濕性AMD。濕性AMD的主要特征是脈絡(luò)膜新生血管(choroidalneovascularization，CNV)，CNV可導(dǎo)致中心視力的突然減退。目前對(duì)于CNV的發(fā)生機(jī)制尚未十分明確，已上市用于CNV治療的藥物主要是針對(duì)已形成的CNV，其作用時(shí)效短且不能根治CNV。CNV的高

2、發(fā)生率、發(fā)生機(jī)制的不明確性、以及難以根治成為醫(yī)學(xué)的重大挑戰(zhàn)。研究表明炎癥反應(yīng)在CNV中起到重要作用，補(bǔ)體旁路途經(jīng)的激活所產(chǎn)生的膜攻擊復(fù)合物(menbraneattackcomples，MAC)在實(shí)驗(yàn)性CNV的發(fā)生中起到?jīng)Q定性作用。補(bǔ)體旁路途徑中有一關(guān)鍵因子為B因子，前期實(shí)驗(yàn)證明通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制旁路途徑中B因子的表達(dá)，可以有效地抑制大鼠CNV的發(fā)生。基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrixmetalloproteinase，MMPS)可以降

3、解細(xì)胞外基質(zhì)，有利于CNV穿過(guò)Bruch膜，研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生CNV時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌MMPs。已有數(shù)種MMPs已被證明存在于AMD患者的CNV中。MMP-13與軟組織退化性關(guān)節(jié)炎及多種癌癥的發(fā)生有關(guān)，具有極強(qiáng)的降解細(xì)胞外基質(zhì)能力，其與激光誘導(dǎo)的大鼠CNV是否有關(guān)還不得而知。前期實(shí)驗(yàn)中已成功構(gòu)建CFB-siRNA，并通過(guò)體外及體內(nèi)研究證明了CFB-siRNA抑制CNV及其相關(guān)生長(zhǎng)因子如VEGF、PDGE等的確切性。前期實(shí)驗(yàn)中未對(duì)CF

4、B-siRNA抑制MAC的沉積做成評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步完善CFB-siRNA抑制實(shí)驗(yàn)性CNV的實(shí)驗(yàn)研究，并進(jìn)一步探討MMP-13與激光誘導(dǎo)的CNV之間的關(guān)系以及MAC的沉積是否能誘導(dǎo)MMP-13的分泌。
　　 方法:
　　 1.CFB-siRNA在體內(nèi)轉(zhuǎn)染靶向性的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 1.18-10周健康棕色挪威(BrownNorway，BN)大鼠24只，隨機(jī)分為2組，每組12只。氪激光(波長(zhǎng)647nm，光斑直徑20

5、0μm，功率260mW,曝光時(shí)間0.05s)圍繞視盤(pán)均勻光凝9個(gè)點(diǎn)，以見(jiàn)到有氣泡產(chǎn)生提示Bruch膜被擊穿為準(zhǔn)建立大鼠CNV模型。
　　 1.2隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組均予激光建立動(dòng)物模型，實(shí)驗(yàn)組通過(guò)尾靜脈注射75μgB因子siRNA，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組通過(guò)尾靜脈注射生理鹽水。注射方式:尾靜脈快速注射法;注藥時(shí)間:光凝后第2天、4天、6天。觀察時(shí)間為激光后3、5、7、14d。于14d時(shí)行熒光素眼底血管造影(FFA)

6、。
　　 1.3處死大鼠，摘除眼球取眼后段組織制作石蠟切片。選取激光斑點(diǎn)及其附近處組織做切片，免疫組織化學(xué)觀察C5b-9(MAC)的表達(dá)情況。
　　 1.4圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　 采用SPSS16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，觀察CFB-siRNA抑制C5b-9(MAC)表達(dá)的情況。
　　 2.MMP-13表達(dá)與CNV形成關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 2.18-10周健康棕色挪威(BrownNorw

7、ay，BN)大鼠30只，分為實(shí)驗(yàn)組、空白組。氪激光(波長(zhǎng)647nm，光斑直徑200μm，功率260mW,曝光時(shí)間0.05s)圍繞視盤(pán)均勻光凝9-10個(gè)點(diǎn)，以見(jiàn)到有氣泡產(chǎn)生提示Bruch膜被擊穿為準(zhǔn)建立大鼠CNV模型。
　　 2.2實(shí)驗(yàn)組予激光建立CNV模型。觀察時(shí)間為激光后3、5、7、14d。實(shí)驗(yàn)組與空白組觀察指標(biāo)為RT-PCR及免疫組織化學(xué)觀察MMP-13的表達(dá)情況。
　　 2.3圖像分析與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。
　　

8、采用SPSS16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 3CNV形成過(guò)程中MAC的沉積能否誘導(dǎo)MMP-13表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 3.18-10周健康棕色挪威(BrownNorway，BN)大鼠24只分為實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，均予激光建立CNV動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)組予尾靜脈注射75μgB因子siRNA，實(shí)驗(yàn)對(duì)照組通過(guò)尾靜脈注射生理鹽水。注藥時(shí)間:光凝后第2天、4天、6天。觀察時(shí)間為激光后3、5、7、14d。
　　 3.

9、2觀察指標(biāo)為RT-PCR及免疫組織化學(xué)觀察MMP-13的變化（免疫組織化學(xué)材料來(lái)自實(shí)驗(yàn)第一部分與第二部分）。
　　 3.3采用SPSS16.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　 結(jié)果:
　　 1CFB-siRNA在體內(nèi)轉(zhuǎn)染靶向性的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 1.1FFA表現(xiàn)為造影早期強(qiáng)熒光斑，晚期出現(xiàn)與視網(wǎng)膜血管無(wú)關(guān)的熒光素滲漏。
　　 1.2實(shí)驗(yàn)組比實(shí)驗(yàn)對(duì)照組CNV發(fā)生率明顯降低。
　　 1.3

10、免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)對(duì)照組C5b-9(MAC)在第3天時(shí)即有沉積，到第5天時(shí)達(dá)高峰，以后逐漸減低。實(shí)驗(yàn)組C5b-9(MAC)一直處于低表達(dá)狀態(tài)。兩組各時(shí)間點(diǎn)相比較MAC的沉積于光凝后第3、5、7天差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2MMP-13表達(dá)與CNV形成關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 2.1免疫組織化學(xué)染色顯示MMP-13表達(dá)位于細(xì)胞漿與細(xì)胞核。在實(shí)驗(yàn)組中MMP-13于光凝后第5天開(kāi)始明顯增多，7天時(shí)達(dá)頂峰，以后至14天時(shí)

11、表達(dá)處于穩(wěn)定。在空白組中一直處于低表達(dá)。兩組各時(shí)間點(diǎn)相比較于光凝后第5、7、14天表達(dá)存在顯著差異。
　　 2.2RT-PCR結(jié)果顯示MMP-13在空白組處于低表達(dá)，在實(shí)驗(yàn)組中MMP-13于光凝后第3天時(shí)表達(dá)即開(kāi)始增加，5天時(shí)持續(xù)增加，7天達(dá)頂峰，以后趨于平穩(wěn)。兩組各時(shí)間點(diǎn)相比較于光凝后第3天開(kāi)始差異即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.CNV形成過(guò)程中MAC的沉積能否誘導(dǎo)MMP-13表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究。
　　 3.1免疫組織

12、化學(xué)及RT-PCR結(jié)果均顯示實(shí)驗(yàn)組與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組MMP-13表達(dá)情況基本一致。
　　 結(jié)論:
　　 1.尾靜脈注射高劑量CFB-SiRNA能夠有效抑制激光誘導(dǎo)大鼠CNV的生成，CFB-SiRNA能靶向性抑制實(shí)驗(yàn)性CNV中C5b-9(MAC)的表達(dá)，同時(shí)也證明導(dǎo)致激光誘導(dǎo)的CNV中MAC沉積的途徑是補(bǔ)體旁路途徑。
　　 2.MMP-13與激光誘導(dǎo)的大鼠CNV的形成有一定相關(guān)性。
　　 3.抑制MAC的沉積不能