結(jié)締組織生長(zhǎng)因子在大鼠肺動(dòng)脈高壓血管重構(gòu)中的表達(dá)及作用.pdf

1、目的： 采用左肺切除+野百合堿建立大鼠PAH新生內(nèi)膜模型，了解該模型肺血管重構(gòu)模式特點(diǎn)；探討CTGF基因在該模型肺組織中的表達(dá)水平和調(diào)控在PAH肺血管重構(gòu)中的作用，以及辛伐他汀減輕PAH肺血管重構(gòu)的作用機(jī)制；并初步分析CTGF促進(jìn)PASMC增殖、遷移和ECM基因表達(dá)在。PAH肺血管重構(gòu)中的作用機(jī)制。 方法： 1．采用單純肺切除(PE)、腹主動(dòng)脈．腔靜脈分流(A-VF)、野百合堿(MCT)、左肺切除+野百合堿(P+

2、M)4種方法建立大鼠PAH模型，檢測(cè)模型大鼠mPAP、RV/LV+S比值、中膜厚度百分比、非肌性小動(dòng)脈肌化程度和新生內(nèi)膜形成，比較4種PAH動(dòng)物模型肺血管重構(gòu)模式的差異。 2．(1)應(yīng)用辛伐他汀對(duì)左肺切除+野百合堿誘導(dǎo)的PAH模型進(jìn)行干預(yù)，觀察模型肺血流動(dòng)力學(xué)改變，并采用血管阻塞計(jì)分、非肌性小動(dòng)脈肌化程度等體視學(xué)指標(biāo)評(píng)價(jià)藥物對(duì)肺血管重構(gòu)的影響程度。 (2)采用原位雜交、熒光定量RT-PCR檢測(cè)CTGF mRNA的表達(dá)，采

3、用免疫組化和Western Blot檢測(cè)CTGF蛋白的表達(dá)。 (3)應(yīng)用Masson染色和羥脯氨酸測(cè)定觀察膠原合成。 (4)應(yīng)用TUNEL染色檢測(cè)肺血管細(xì)胞凋亡。 (5)應(yīng)用PCNA免疫組化染色檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。 (6)測(cè)定血管阻塞計(jì)分了解肺血管狹窄情況。 (7)應(yīng)用辛伐他汀干預(yù)后進(jìn)行生存率分析。 3．在體外應(yīng)用重組CTGF作用于培養(yǎng)PASMC，檢測(cè)CTGF對(duì)PASMC增殖、遷移、細(xì)胞骨架

4、改變，以及膠原和纖維連接蛋白基因表達(dá)的影響。 結(jié)果： 1．在P+M組(肺切除術(shù)后5周)右肺腺泡內(nèi)血管出現(xiàn)新生內(nèi)膜病變，其它組均沒(méi)有新生內(nèi)膜病變形成。P+M組動(dòng)物出現(xiàn)了嚴(yán)重的右心室肥大，動(dòng)脈中膜明顯增厚，平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)和無(wú)肌性血管肌化程度顯著增加；A-VF、PE和MCT組僅形成輕．中度的右心室肥大、mPAP升高和小動(dòng)脈肌化。 2．與正常大鼠比較，應(yīng)用原位雜交和免疫組化檢測(cè)顯示大鼠PAH新生內(nèi)膜模型CTGF

5、 mRNA和蛋白表達(dá)增加，且主要表達(dá)在PASMC、間質(zhì)的巨噬細(xì)胞，熒光定量RT-PCR和Western Blot檢測(cè)顯示ET-1mRNA、CTGF mRNA和蛋白水平明顯較對(duì)照組大鼠有顯著升高，且膠原合成也較對(duì)照組大鼠明顯增加。給予辛伐他汀干預(yù)后，PAH大鼠ET-1mRNA、CTGF mRNA 和蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，膠原合成減少；肺血管壁細(xì)胞增殖減少，細(xì)胞凋亡率增加；減輕非肌性小動(dòng)脈肌化程度和血管阻塞，抑制新生內(nèi)膜形成，且抑制右室肥大

6、和動(dòng)脈中膜肥厚，緩解PAH。辛伐他汀早期和晚期干預(yù)將PAH大鼠生存率由75％(PMV<,1-35>)和66．67％(PMV<,21-35>)分別提高至100％(PMS<,1-35>)和83．33％(PMS<,21-35>)。 3．體外實(shí)驗(yàn)中，重組CTGF促進(jìn)PASMC增殖、遷移；促進(jìn)PASMC細(xì)胞周期進(jìn)程，不增加PASMC凋亡；促進(jìn)Ⅰ、Ⅳ型膠原-α1和纖維連接蛋白-1 mRNA表達(dá)；可短暫改變PASMC細(xì)胞骨架。 結(jié)論：

7、 1．4種動(dòng)物模型中，僅P+M能成功誘導(dǎo)大鼠PAH新生內(nèi)膜模型，該模型能更好地模擬人類嚴(yán)重PAIl的病理改變，是研究梗阻性PAH更為適用的動(dòng)物模型。 2．CTGF表達(dá)上調(diào)可能在PAH肺血管重構(gòu)過(guò)程中起重要作用，辛伐他汀可能通過(guò)下調(diào)CTGF基因表達(dá)減輕肺血管重構(gòu)。 3．辛伐他汀通過(guò)抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡阻止P+M誘導(dǎo)的PAH大鼠肺血管重構(gòu)的形成。 4．CTGF促進(jìn)PASMC增殖、遷移、細(xì)胞骨架改