豬傳染性胃腸炎檢測(cè)基因芯片與豬傳染性胃腸炎病毒SC-H株N基因表達(dá)研究.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(TransmissibleGastroenteritisenteritis，TGE)是由豬傳染性胃腸炎病毒引起的一種高度接觸性腸道傳染病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)病仔豬嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水，該病給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的損失。本研究從病原學(xué)上證實(shí)了該病在四川的流行，建立了TGEV基因芯片檢測(cè)新方法，進(jìn)行了重要功能基因的分子生物學(xué)研究，對(duì)TGE的診斷、預(yù)防和控制具有重要意義。 1豬傳染性胃腸炎病毒SC-H株的分離鑒定

2、 將腹瀉病料接種到到ST細(xì)胞(豬睪丸傳代細(xì)胞)上，連續(xù)盲傳5代后開(kāi)始出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變，病變?cè)诮佣竞?0h開(kāi)始出現(xiàn)，表現(xiàn)為：細(xì)胞腫脹、變圓、有散在堆積、最后細(xì)胞皺縮、崩解破碎，脫落。該病毒的TCID50為10-3.92/0.04ml、病毒能被豬傳染性胃腸炎病毒陽(yáng)性血清所中和，中和指數(shù)為242；透射電鏡觀察細(xì)胞中聚集大量的病毒粒子，病毒粒子呈球形，大小約75-90nm，病毒以胞外分泌的方式釋放到細(xì)胞外；病毒對(duì)5溴脫氧尿核苷不敏感，為R

3、NA病毒，對(duì)乙醚、氯仿敏感，對(duì)胰蛋白酶有抵抗力，pH4.0-pH8.0穩(wěn)定。將分離鑒定的病毒命名為SC-H株。SC-H株的分離為該病的病原學(xué)研究、診斷和防制積累了材料。 2TGEVSC-H株主要基因的克隆與分析 用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增了豬傳染性胃腸炎病毒SC-H株的S(分為S1、S2、S3、S4四段)、sM、M、N、ORF7、S及POL基因，將擴(kuò)增片段插入pMD18-T載體構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD-S1、pMD-S2、pMD

4、-S3、pMD-S4、pMD-sM、pMD-M、pMD-N、pMD-ORF7、pMD-S及pMD-POL，核苷酸測(cè)序結(jié)果顯示S1、S2、S3、S4長(zhǎng)度分別為1260bp、1280bp、1062bp、1217bp，序列拼接后S基因片段長(zhǎng)4542bp；sM、M、N，ORF7、S和POL擴(kuò)增片段長(zhǎng)度分別為378bp、852bp、1188bp、436bp、886bp及303bp。S、sM、M、N和ORF7擴(kuò)增片段分別包括TGEV完整的ORF2、

5、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7，長(zhǎng)度分別為4344bp、249bp、789bp、1149bp和237bp，分別編碼1147、82、262、382、78個(gè)氨基酸。S、sM、M、N、ORF7編碼區(qū)的核苷酸序列和其他參考毒株的核苷酸序列同源性分別在98.1-99.8％、98.1-99.7％、94.2-99.7％、98.1-99.9％及93.6-99.5％之間，氨基酸同源性在94.1-99.7％、92.7-98.8％、92.0-99.2

6、％、95.3-99.5％及84.8-96.2％之間。進(jìn)化分析顯示SC-H株與Purdue株有相對(duì)較近的遺傳距離。TGEV主要基因的克隆與分析為后續(xù)構(gòu)建檢測(cè)基因芯片和研究功能基因奠定了基礎(chǔ)。 3TGEV檢測(cè)基因芯片的初步構(gòu)建 從重組質(zhì)粒pMD-S1、pMD-S2、pMD-S3、pMD-S4、pMD-sM、pMD-M、pMD-N、pMD-ORF7、pMD-S及pMD-POL中直接擴(kuò)增了TGEV的靶基因，并采用異丙醇沉淀的方法

7、純化。在40℃、44℃、48℃、52℃、56℃對(duì)這些靶基因進(jìn)行雜交，確定了S、S3、sM、M、N、ORF7、POL等7個(gè)基因作為TGEV檢測(cè)芯片的靶基因。確定了TGE芯片的最佳反應(yīng)條件及參數(shù)：在氨基化玻片上的一個(gè)陣列內(nèi)，每個(gè)靶基因點(diǎn)1排，每排12個(gè)樣點(diǎn)，點(diǎn)與點(diǎn)中心距為650μm，樣點(diǎn)直徑為220μm；點(diǎn)樣環(huán)境參數(shù)為濕度55-65％，溫度15-30℃，點(diǎn)樣后室溫干燥過(guò)夜；60-80℃水合處理10sec；紫外線交聯(lián)30min和0.2％SDS

8、洗滌5min，再以蒸餾水快速洗滌后離心干燥，密封保存。最佳靶基因點(diǎn)樣濃度為200ng/μl，最佳探針濃度為3000pg/μl，Cy3-dCTP標(biāo)記濃度為2.5μmol/L，預(yù)雜交時(shí)間為1h，雜交時(shí)間為6h，雜交溫度為48℃。 用多重PCR技術(shù)對(duì)TGEV樣品進(jìn)行標(biāo)記，TGEV混合探針與TGE芯片雜交效果好。TGE檢測(cè)基因芯片與HCV、PPV、PRV、PRRSV、JEV、APP等疾病無(wú)交叉反應(yīng)。該芯片能檢測(cè)出最低含量為10ng/μl

9、的探針。芯片的批間試驗(yàn)和批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果均無(wú)顯著差異，一張芯片至少可重復(fù)利用10次。用軟件QuantArray(R)Ver3.0獲取和分析芯片數(shù)據(jù)，確定信號(hào)中位強(qiáng)度值≥1000，SNR值≥1.5為TGE基因芯片檢測(cè)的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)。TGE檢測(cè)芯片具有特異性好、靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。TGE檢測(cè)芯片為TGE的診斷提供了一種特異性更高的基因檢測(cè)新方法，也可用于構(gòu)建多個(gè)豬病聯(lián)合檢測(cè)芯片。 4豬傳染性胃腸炎病毒SC-H株N基因的表研究

10、 用設(shè)計(jì)的一對(duì)引物從重組質(zhì)粒pMD-N中擴(kuò)增了豬傳染性胃腸炎病毒N基因編碼區(qū)，將其插入pMD18-T載體構(gòu)建了pMD18-T-N重組質(zhì)粒，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后將N基因亞克隆進(jìn)PET-32a(+)表達(dá)載體，構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒PET-32a-N并對(duì)其進(jìn)行酶切鑒定和核苷酸序列測(cè)定。將PET-32a-N質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL2l(DE3)大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)的最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.8mmol/L，最佳誘導(dǎo)時(shí)間為3h，最大表達(dá)量可達(dá)菌體總