子癇前期蛻膜組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、子癇前期是妊娠期特有疾病，是妊娠高血壓疾病的最常見類型，起病于34孕周前的重度子癇前期稱為早發(fā)型重度子癇前期(ES-PE)，在34孕周以后發(fā)病的重度子癇前期稱為晚發(fā)型重度子癇前期(LS-PE)。目前子癇前期仍然沒有理想的標(biāo)志物，具體的發(fā)病機(jī)制仍未闡明。近年研究發(fā)現(xiàn)早發(fā)型重度子癇前期與晚發(fā)型重度子癇前期不僅是發(fā)病時(shí)間上存在差異，在發(fā)病機(jī)制、臨床靶器官損害、臨床治療及預(yù)后等方面都有明顯不同。蛋白質(zhì)組學(xué)是近年來發(fā)展的新技術(shù)，主要包含蛋白質(zhì)分離

2、、蛋白質(zhì)鑒定和生物信息學(xué)三大部分，具有高通量和高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)。人體蛻膜組織是母胎界面重要組成部分，與胎兒滋養(yǎng)層直接接觸，有參與母胎免疫耐受形成及維持妊娠的功能。為探討子癇前期的發(fā)病機(jī)制和尋找該病的蛋白質(zhì)標(biāo)志物，既往國內(nèi)外學(xué)者曾運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對子癇前期患者的外周血、腦脊液、羊水和胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞等進(jìn)行了各種研究。關(guān)于子癇前期蛻膜組織的蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，通過比較早發(fā)型重度子癇前期、晚發(fā)型重度子癇前期患者和正

3、常足月妊娠婦女蛻膜組織的蛋白表達(dá)差異，探討引起子癇前期發(fā)生的可能因素及尋找子癇前期是否存在標(biāo)志蛋白，為研究子癇前期的發(fā)病機(jī)制和診斷提供依據(jù)。 第一章子癇前期蛻膜組織差異表達(dá)蛋白的分離與鑒定 目的：探討早發(fā)型重度子癇前期、晚發(fā)型重度子癇前期和正常足月妊娠各組蛻膜組織差異蛋白表達(dá)譜的變化，篩選出早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期相關(guān)蛋白。 方法：正常足月妊娠、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期各6例，剖宮產(chǎn)術(shù)

4、中取出蛻膜組織，采用一步抽提法制備各組蛻膜組織的總蛋白，應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)建立正常足月妊娠、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期蛻膜組織雙向凝膠電泳圖譜。PDQuest軟件進(jìn)行圖像分析分別對各組蛻膜組織總蛋白的雙向電泳圖譜進(jìn)行了分析比較，隨機(jī)選擇各組間的差異點(diǎn)共30個(gè)進(jìn)行膠內(nèi)酶解，用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析獲得肽質(zhì)量指紋譜，搜尋蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)并進(jìn)行初步功能分析。 結(jié)果：

5、 1.建立了分辨率高、重復(fù)性好的正常足月妊娠、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期蛻膜組織的2-DE圖譜，其中蛋白質(zhì)點(diǎn)正常足月妊娠組(425±16)個(gè)，早發(fā)型重度子癇前期組(408±10)個(gè)，晚發(fā)型重度子癇前期組(436±13)個(gè)。 2.PDQuest進(jìn)行圖像分析軟件對三組2-DE圖譜進(jìn)行比較分析，以比值大于2或小于2的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)作為顯著差異表達(dá)的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。隨機(jī)選擇9個(gè)晚發(fā)組和正常妊娠組的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)和11個(gè)早發(fā)組與晚發(fā)組中

6、差異點(diǎn)和15個(gè)早發(fā)組與正常妊娠組中的差異點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定分析，共鑒定出29種差異蛋白質(zhì)。 3.鑒定出29種蛋白質(zhì)按功能分為10類：①細(xì)胞結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白質(zhì)；②信號傳導(dǎo)相關(guān)蛋白；③能量與代謝相關(guān)的酶類；④鈣結(jié)合蛋白質(zhì)；⑤其他(fibrinogen double fragment、fibrinogen beta chain precursor、proteasome endopeptidase complex[3.4.5.1]P42 cha

7、in、hemoglobin beta chain)；⑥抗氧化物酶類；⑦分子伴侶；⑧運(yùn)輸?shù)鞍?；⑨防御性蛋白；⑩未知蛋白?結(jié)論： 1.成功建立正常足月妊娠、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期蛻膜組織總蛋白質(zhì)的2-DE圖譜，共鑒定了出29種差異蛋白質(zhì)。 2.多個(gè)能量代謝相關(guān)的蛋白和多個(gè)凝血功能相關(guān)的蛋白在正常妊娠組和子癇前期組之間存在表達(dá)差異推測：母胎界面缺氧應(yīng)激和血液高凝狀態(tài)可能是子癇前期發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

8、 3.首次進(jìn)行了早發(fā)型子癇前期的比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)了早發(fā)型子癇前期蛻膜組織與晚發(fā)型子癇前期蛻膜組織相比存在差異蛋白，提示早發(fā)型子癇前期的發(fā)病機(jī)制可能不同于晚發(fā)型子癇前期。 第二章子癇前期蛻膜組織比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究 目的：驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，對部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)在正常足月妊娠、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期蛻膜組織中的mRNA及蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測，分析其臨床意義。 方法：收集正常足月妊娠、早發(fā)型

9、重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期各10例蛻膜組織，分別采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)分別對正常足月妊娠婦女、早發(fā)型重度子癇前期及晚發(fā)型重度子癇前期蛻膜組織中的AnnexinⅤ和Rho-GDI的mRNA及蛋白進(jìn)行檢測。 結(jié)果 1.熒光實(shí)時(shí)定量PCR,Western blot和免疫組化等結(jié)果顯示Annexin Ⅴ mRNA及蛋白在正常妊娠組蛻膜組織中表達(dá)最高，晚發(fā)型子癇前期組中次之，早發(fā)型

10、子癇前期中最低，正常妊娠組與早發(fā)組和晚發(fā)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。 2.熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot和免疫組化等結(jié)果顯示Rho-GDI mRNA及蛋白在正常妊娠組蛻膜組織中表達(dá)最高，早發(fā)型子癇前期組中次之，晚發(fā)型子癇前期中最低，正常妊娠組與早發(fā)組和晚發(fā)組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果一致。 結(jié)論： 1.蛻膜組織中Annexin Ⅴ和Rho-GDI各組間存在差異表達(dá)，差異表達(dá)水平

11、與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果基本一致。 2.AnnexinⅤ在子癇前期蛻膜組織中表達(dá)下調(diào)，AnnexinⅤ的低表達(dá)可能與子癇前期高凝狀態(tài)形成有關(guān)。 3.Rho-GDI在子癇前期蛻膜組織中表達(dá)下調(diào)，Rho-GDI可能通過血壓調(diào)節(jié)和缺氧應(yīng)激等多個(gè)環(huán)節(jié)參與了子癇前期的發(fā)生發(fā)展。 第三章α1-antitrypsin在子癇前期患者蛻膜組織中的表達(dá)和母體外周血中的濃度變化及其臨床意義 目的：對α1-antitrypsin在正常足月妊娠、

12、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期蛻膜組織中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測，驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)果，并研究母體外周血清α1-抗胰蛋白酶蛋白濃度變化和探討其臨床意義。 方法：采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot和免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測α1-antitrypsin在正常足月妊娠、早發(fā)型重度子癇前期和晚發(fā)型重度子癇前期各10例蛻膜組織中的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測每組各20例母體外周血清α1-antitrypsin的濃度。

13、 結(jié)果： 1.熒光實(shí)時(shí)定量PCR、Western blot和免疫組化等結(jié)果顯示α1-抗胰蛋白酶mRNA及蛋白在正常妊娠組蛻膜組織中表達(dá)最高；早發(fā)型子癇前期組中次之；晚發(fā)型子癇前期中最低，差異有顯著性意義。 2.母體外周血清α1-antitrypsin的濃度在正常妊娠組表達(dá)最高(1.85±0.15g/L)；早發(fā)型子癇前期組中次之(0.77±0.14g/L)和晚發(fā)型子癇前期中最低(0.42±0.07g/L)，差異有顯