米非司酮對體外大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：本實驗通過研究不同劑量米非司酮對體外培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響，探討米非司酮與卵泡發(fā)育的關(guān)系及臨床應(yīng)用米非司酮治療子宮內(nèi)膜異位癥等激素依賴性疾病的可能機制，為米非司酮的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。 方法 選取4-5周齡未成年SD雌性大鼠，腹腔注射60單位的孕馬血清促性腺激素(PMS6)以刺激卵泡發(fā)育，48小時后處死大鼠取卵巢，機械法分離顆粒細胞，體外培養(yǎng)24小時貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基，并分別加入10<'-6> mol

2、/L(低劑量組)、10<'-5>mol/L(中劑量組)、10<'-4>mol/L(高劑量組)的米非司酮繼續(xù)培養(yǎng)24小時，對照組為空白組。通過電鏡下超微結(jié)構(gòu)觀察對顆粒細胞進行鑒定，運用流式細胞術(shù)結(jié)合熒光染色,(Hoechst 33342)了解不同濃度米非司酮對顆粒細胞形態(tài)學(xué)及生物學(xué)的影響，免疫細胞化學(xué)法觀察不同濃度米非司酮下顆粒細胞中Fas的表達，化學(xué)發(fā)光法測定不同濃度米非司酮處理顆粒細胞后的雌二醇和孕酮水平。 用One-way

3、ANOVA和LSD法檢驗的統(tǒng)計學(xué)方法進行處理組與對照組及兩兩組間數(shù)據(jù)比較分析，方差不齊則選用調(diào)整方差齊性的dunnett檢驗進行兩兩比較，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)。所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包進行處理。 結(jié)果: 1.原代培養(yǎng)大鼠卵巢顆粒細胞，活細胞數(shù)量可達90％以上，體外培養(yǎng)24小時后，顆粒細胞貼壁生長，胞質(zhì)富含顆粒，細胞間出現(xiàn)纖維性連接。透射電鏡下可看到所收集細胞中顆粒細胞達80％～85％，其特征性的超

4、微結(jié)構(gòu)：胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)管狀嵴線粒體，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(SER)豐富，出現(xiàn)電子密度較高的類脂滴。 2.流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，隨米非司酮濃度增加，顆粒細胞凋亡率增加，低劑量組(6.7％±0.73％)與對照組(7.5％±0.88％)間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，中劑量組(9.53％±0.78％)、高劑量組(13％±1.75％)與對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，各處理組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。進一步結(jié)合熒光顯微鏡觀察細胞

5、凋亡情況，細胞核致密濃染的凋亡細胞數(shù)量隨米非司酮劑量增加而增多，細胞凋亡率低劑量組(4.18％±0.90％)與對照組(1.49±2.20％)間無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，中劑量組(6.63％±1.48％)、高劑量組(15.45％±3.89％)與對照組間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，各處理組之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。 3.免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示：顆粒細胞中Fas蛋白表達隨米非司酮處理劑量的增加而增強，陽性表達率低劑量組(0

6、.2902±0.0652)、中劑量組(0.3639±0.0748)、高劑量組(0.5572±0.0673)與對照組(0.1944±0.0818)之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，各組間均有差異(P<0.05)。 4. 離體顆粒細胞孕酮的水平隨米非司酮濃度增加而降低。低劑量組(2.27±0.55pg/ml)、中劑量組(0.56±0.16 pg/ml)、高劑量組(0.18±0.08 pg/ml)與對照組(7.67±1.67 pg

7、/ml)之間有差異(P<0.01)，各處理組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)：雌二醇水平?jīng)]有受到明顯影響，組間統(tǒng)計學(xué)上無差異(P>0.05)。 結(jié)論 1．米非司酮可誘導(dǎo)顆粒細胞發(fā)生凋亡，離體顆粒細胞凋亡率隨米非司酮劑量增加而增高，可能是米非司酮抑制卵泡發(fā)育和激素水平，治療子宮內(nèi)膜異位癥等激素依賴性疾病的機制之一。 2．米非司酮可能通過調(diào)節(jié)顆粒細胞表面凋亡因子Fas蛋白的表達而誘導(dǎo)顆粒細胞凋亡，從而影響孕酮的分泌