Rab8和肌球蛋白Ⅴc參與2型登革病毒感染的研究.pdf

1、登革病毒屬于黃病毒家族，是一種有包膜的單鏈RNA病毒，它包括四種不同的血清型，分別為DV1、DV2、DV3和DV4。登革病毒感染引起的癥狀較為復(fù)雜，從沒有明顯或者是僅有輕度癥狀的登革熱，到病勢(shì)兇險(xiǎn)伴有多種綜合癥狀的登革出血熱和登革休克綜合征。在過去的幾十年中，該病毒以埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白紋伊蚊為媒介昆蟲，在全世界熱帶和亞熱帶地區(qū)大面積流行，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，每年全世界有近1億人感染DV，其中以與我國(guó)接壤的東南亞地

2、區(qū)流行最為嚴(yán)重。DV感染已經(jīng)成為一個(gè)越來越嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，它正時(shí)刻威脅著人類的健康。但遺憾的是，迄今為止DF和DHF/DSS的致病機(jī)制尚未完全闡明。 本研究的主要結(jié)果和結(jié)論如下： 一、Rab8截短體蛋白的原核表達(dá)、純化及其抗體制備 首先，采用RT-PCR方法從HepG2細(xì)胞總RNA中T-A克隆了人Rab8基因，構(gòu)建了pMD19T-Rab8質(zhì)粒，針對(duì)Rab8蛋白的C端122個(gè)氨基酸設(shè)計(jì)一對(duì)亞克隆引物，以pMD1

3、9T-Rab8質(zhì)粒為模板，用PCR擴(kuò)增和BamH I/HindIII雙酶切方法將Rab8-122的DNA片段定向亞克隆到原核表達(dá)載體中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pQE31-Rab8-122。該質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測(cè)序檢驗(yàn)構(gòu)建的準(zhǔn)確性。 隨后，對(duì)含有pQE31-Rab8-122質(zhì)粒的工程菌誘導(dǎo)表達(dá)，1 mM IPTG誘導(dǎo)4 h即可獲得以包涵體形式表達(dá)的目標(biāo)蛋白。用Ni親和層析、pH梯度洗脫和透析的方法純化目標(biāo)蛋白。用抗His抗體可以檢測(cè)到We

4、stern blot反應(yīng)膜上的目標(biāo)蛋白，其大小約為15 kDa，與預(yù)期大小一致。 最后，用獲得的Rab8截短體蛋白免疫動(dòng)物制備抗Rab8多克隆抗體。經(jīng)ELISA檢測(cè)，制備的抗血清效價(jià)達(dá)1:20000。Western blot實(shí)驗(yàn)證明，1:500稀釋的自制兔抗Rab8抗體，能夠與誘導(dǎo)表達(dá)的6xHis-Rab8-122蛋白以及HepG2細(xì)胞中分子量約為24 kDa的內(nèi)源性Rab8蛋白發(fā)生特異的抗原抗體反應(yīng)。Rab8抗血清的成功制備為

5、后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。 二、Myo5c截短體蛋白的原核表達(dá)、純化及其抗體制備 首先，根據(jù)My05c特異性的α-螺旋區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用RT-PCR方法從人胃黏膜組織總RNA中獲得目標(biāo)片段，用BamH I/Sal I雙酶切方法將My05c-297片段的DNA編碼序列定向克隆到原核表達(dá)載體，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pQE31-Myo5c-297。該質(zhì)粒經(jīng)雙酶切和測(cè)序檢驗(yàn)構(gòu)建的準(zhǔn)確性。 用1 mM IPTG對(duì)含有pQE31-My0

6、5c-297質(zhì)粒的工程菌誘導(dǎo)表達(dá)。獲得的目標(biāo)蛋，用Ni親和層析、pH梯度洗脫和透析的方法純化。用抗His抗體可以檢測(cè)到Western blot反應(yīng)膜上的目標(biāo)蛋白，其大小約為42 kDa，與預(yù)期大小一致。 最后，用獲得的Myo5c截短體蛋白免疫動(dòng)物制備抗Myo5c多克隆抗體。經(jīng)ELISA檢測(cè)，制備的抗血清效價(jià)達(dá)1:12800。Western blot實(shí)驗(yàn)證明，1:500稀釋的自制小鼠抗Myo5c抗體，能夠與誘導(dǎo)表達(dá)的6xHis-M

7、yo5c-297蛋白以及HepG2細(xì)胞中分子量約為20.kDa的內(nèi)源性Myo5c蛋白發(fā)生特異的抗原抗體反應(yīng)。1:200稀釋的Myo5c抗血清還能檢測(cè)人結(jié)腸黏膜切片中Myo5c抗原。Myo5c抗血清的成功制備為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。 三、Rab8參與2型登革病毒復(fù)制周期 1、Rab8和DV2在HepG2細(xì)胞內(nèi)高度共存 DV2感染HepG2細(xì)胞，胞內(nèi)的Rab8分布并沒有出現(xiàn)非常顯著的改變，仍然分布于核周到細(xì)胞膜之間的

8、區(qū)域。但是在胞內(nèi)點(diǎn)狀分布的DV2抗原位置也有明顯相同點(diǎn)狀的Rab8抗原存在。用激光共聚焦分析這些點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Rab8與DV2高度共存，其共存率大于90％。這提示，Rab8可能參與DV2感染細(xì)胞的過程。 2、穩(wěn)定表達(dá)Rab8正、負(fù)突變體HepG2細(xì)胞的建立 為進(jìn)一步研究Rab8在DV復(fù)制周期中的作用，我們利用脂質(zhì)體法分別將pcDNA3.1、pcDNA3.1-Rab8Q67L和pcDNA3.1-Rab8T22N超純質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

9、至HepG2細(xì)胞，經(jīng)過篩選，成功地獲得具有G418抗性的細(xì)胞株，分別命名為HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN，經(jīng)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法鑒定Rab8正、負(fù)突變體在HepG2RabsAM和HepG2Rab8DN細(xì)胞中的表達(dá)，證明所構(gòu)建的細(xì)胞株可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。 3、表達(dá)Rab8正、負(fù)突變體導(dǎo)致DV2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)減少 免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)：DV2感染HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Ra

10、b8DN細(xì)胞后24h，大約有60％的HepG2p3.1細(xì)胞表現(xiàn)為病毒抗原陽(yáng)性，而HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN細(xì)胞中則最多有20％-30％的細(xì)胞呈現(xiàn)為病毒抗原陽(yáng)性。這說明，表達(dá)Rab8正、負(fù)突變體影響到DV2感染細(xì)胞的過程。 4、表達(dá)Rab8正、負(fù)突變體導(dǎo)致培養(yǎng)上清中的子代病毒的釋放減少 利用空斑實(shí)驗(yàn)，在DV感染后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN細(xì)胞培養(yǎng)上清

11、中病毒滴度發(fā)現(xiàn)：在感染后8 h，三者所產(chǎn)生的子代病毒沒有顯著變化；但在感染后24和48 h，以HepG2p3.1細(xì)胞為對(duì)照，HepG2Rab8AM細(xì)胞培養(yǎng)上清中子代病毒分別減少了97.0％和82.2％；同樣HepG2Rab8DN細(xì)胞培養(yǎng)上清中子代病毒分別減少77.2％和53.3％。這表明Rab8正、負(fù)突變體的表達(dá)能夠抑制子代DV的釋放；且較之于Rab8負(fù)突變體， Rab8正突變體作用更為顯著。 5、表達(dá)Rab8正、負(fù)突變體抑制胞

12、內(nèi)侵染性病毒顆粒的產(chǎn)生 同樣利用空斑實(shí)驗(yàn)，在感染后8、24和48 h，檢測(cè)HepG2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN細(xì)胞內(nèi)病毒滴度發(fā)現(xiàn)：在感染后8 h，三者胞內(nèi)合成的侵染性病毒顆粒沒有顯著變化；但在感染后24和48 h，HepG2p3.1細(xì)胞胞內(nèi)的DV2顆粒隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增加；與之相比較，表達(dá)Rab8正突變體Rab8Q67L分別使胞內(nèi)病毒滴度降低了96.4％和78.8％；表達(dá)Rab8負(fù)突變體Ra

13、b8T22N也分別使胞內(nèi)病毒滴度降低了86.4％和80.2％。這表明Rab8正、負(fù)突變體的表達(dá)，能夠抑制細(xì)胞內(nèi)侵染性病毒顆粒的產(chǎn)生，Rab8可能是HepG2細(xì)胞中參與DV2成熟過程的重要宿主因子。 6、表達(dá)Rab8正、負(fù)突變體能夠抑制病毒RNA復(fù)制 為進(jìn)一步闡明表達(dá)Rab8正、負(fù)突變體使細(xì)胞內(nèi)DV2產(chǎn)生減少的原因，在DV2感染后不同時(shí)相點(diǎn)，利用real-time RT-PCR方法，檢測(cè)了HepG2p3.1、HepG2Ra

14、b8AM和HepG2Rab8DN細(xì)胞中DV2 NS1基因的相對(duì)水平。我們發(fā)現(xiàn)感染后24和48 h，表達(dá)Rab8正突變體Rab8Q67L分別使胞內(nèi)病毒RNA降低了51％和28.5％；表達(dá)Rab8負(fù)突變體Rab8T22N也分別使胞內(nèi)病毒RNA降低了33％和36％。結(jié)果表明，表達(dá)Rab8正、負(fù)突變體可在一定程度下調(diào)病毒RNA復(fù)制。 7、表達(dá)Rab8正、負(fù)突變體抑制病毒進(jìn)入HepG2細(xì)胞 利用病毒進(jìn)入的實(shí)驗(yàn)方法，檢測(cè)了進(jìn)入Hep

15、G2p3.1、HepG2Rab8AM和HepG2Rab8DN細(xì)胞的病毒顆粒數(shù)量發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照相比較，表達(dá)Rab8正突變體Rab8Q67L抑制81.3％病毒進(jìn)入，表達(dá)Rab8負(fù)突變體Rab8T22N可抑制79.7％病毒進(jìn)入細(xì)胞。結(jié)果表明，Rab8參與了DV2進(jìn)入HepG2細(xì)胞的過程。 四、Myo5c參與2型登革病毒釋放 1、Myo5c tail穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的建立 首先構(gòu)建了Myo5c tail真核表達(dá)質(zhì)粒pCI-M

16、yo5c-tail，以pCI-neo空載體為對(duì)照，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，利用篩選培養(yǎng)基獲得具有G418抗性的細(xì)胞株，分別命名為HepG2pCI和HepG2Myo5c-tail。Western Bolt檢驗(yàn)結(jié)果顯示，用鼠抗Myo5c抗血清可以檢測(cè)到HepG2pCI和HepG2Myo5c-tail細(xì)胞中內(nèi)源性的Myo5c蛋白，大小約為20.kDa，而在HepG2Myo5c-tail細(xì)胞中除了可以檢測(cè)到內(nèi)源性的Myo5c蛋白外還可以檢

17、測(cè)到轉(zhuǎn)染pCI-Myo5c-tail質(zhì)粒表達(dá)的Myo5c tail蛋白，大小約為93 kDa。 2、HepG2細(xì)胞中Myo5c可能與Rab8存在相互關(guān)聯(lián) 間接免疫熒光雙染色法結(jié)果表明，Rab8和Myo5c均分布于核周到細(xì)胞膜區(qū)域，共聚焦分析兩者共存率在局部區(qū)域高達(dá)90％。說明在HepG2細(xì)胞中Myo5c與Rab8高度共存。 用流式細(xì)胞免疫染色計(jì)數(shù)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HepG2Myo5c-tail訓(xùn)細(xì)胞中內(nèi)源性Rab8表達(dá)