肝纖維化中肝星狀細(xì)胞遷移及RhoA作用機制的研究.pdf

1、第一部分 膠原、生長因子(TGFB。、PDGF-BB)對大鼠肝星狀細(xì)胞遷移及細(xì)胞骨架的影響 背景與目的：肝星狀細(xì)胞(HSC)在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，在肝纖維化時，活化的HSC細(xì)胞增殖、收縮、分泌細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)成分合成增加，引起Disse間隙微環(huán)境的改變。從細(xì)胞生物學(xué)角度來看，HSC的活化及遷移至少包括細(xì)胞增殖變形、細(xì)胞內(nèi)纖維增生，細(xì)胞收縮性的獲得和通過信號傳導(dǎo)釋放各種細(xì)胞因子等改變。就大多數(shù)細(xì)胞而言這些

2、環(huán)節(jié)均與疾病狀態(tài)下的細(xì)胞骨架重排有關(guān)。本實驗?zāi)康脑谟谘芯磕z原、生長因子(TGFβ1。、PDGF-BB)對大鼠肝星狀細(xì)胞遷移及細(xì)胞骨架的影響。 方法：分離培養(yǎng)原代大鼠肝星狀細(xì)胞，用改良的TranswellChamber觀察不同濃度膠原、生長因子(TGFβ1、PDGF-BB)直接及趨化刺激后細(xì)胞遷移改變，免疫熒光標(biāo)記肌動蛋白細(xì)胞骨架，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察生長因子(TGFβ1、PDGF-BB)誘導(dǎo)后HSC細(xì)胞骨架的變化。

3、結(jié)果： 1．TGFβ1、PDGF-BB趨化及直接刺激均可引起HSC細(xì)胞遷移增加，與對照組相比，各濃度TGFβ1、PDGF-BB刺激后遷移細(xì)胞增加差異有顯著性意義(P(O．01)；10μg/mlI型膠原趨化及直接刺激后HSC遷移增加不明顯，當(dāng)濃度達(dá)到50μg/m1時，其趨化刺激誘導(dǎo)遷移增加與對照組比較差異有顯著性(Pi0．05)，當(dāng)濃度達(dá)到100μg／m1時，其直接刺激誘導(dǎo)遷移增加與對照組比較差異有顯著性(P(O．05)；不同濃度

4、Ⅳ型膠原趨化及直接刺激對HSC遷移均無明顯影響。 2．激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，生長因子誘導(dǎo)前大鼠肝星狀細(xì)胞呈圓形，體積較小，TGFβ1、PDGF-BB刺激后細(xì)胞呈快速的形態(tài)改變：5ng/mlTGFβ1刺激5min后可見細(xì)胞伸展，絲狀偽足形成，15min后可見應(yīng)力纖維，30min時應(yīng)力纖維較前增加，并見粘著斑形成；10ng／m1PDGF-BB刺激5min后出現(xiàn)板狀偽足，15min時出現(xiàn)應(yīng)力纖維及粘著斑，少量絲狀偽足，30min時

5、應(yīng)力纖維及絲狀偽足較前增加。 結(jié)論：I型膠原、TGFβ1、PDGF-BB均可促進肝星狀細(xì)胞遷移，而Ⅳ型膠原對HSC遷移無影響；TGFβ1、PDGF-BB可誘導(dǎo)HSC細(xì)胞骨架的重建。I型膠原與生長因子可通過此機制促進肝纖維化發(fā)展。 第二部分 TGFB1、PDGF-BB對大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)RhoGTPase信號通路的影響 背景與目的：Rho家族小G蛋白是細(xì)胞骨架肌動蛋白的重要調(diào)節(jié)因子，目前眾多的研究集中在Rho

6、家族成員中的Cdc42、Racl和RhoA上。在細(xì)胞極化、細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及遷移過程中，Rho家族GTP酶是聯(lián)系細(xì)胞外信號與肌動蛋白細(xì)胞骨架系統(tǒng)的關(guān)鍵因子。我們已證實TGFB1、PDGF-BB可誘導(dǎo)HSC細(xì)胞骨架改變及促進細(xì)胞遷移，現(xiàn)進一步研究在此過程中RhoGTP酶的表達(dá)，初步推斷其在HSC細(xì)胞遷移中的信號傳導(dǎo)機制。 方法：用實時熒光定量PCR、Westernblot及GSTpulldown方法檢測不同濃度TGFβ1及PDGF一陰

7、刺激后大鼠HSC內(nèi)RhoA、Racl、Cdc42mRNA、總蛋白及活性蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果： L實時熒光定量PCR結(jié)果顯示：與對照組相比，TGFβ1刺激后RhoAmRNA表達(dá)增加，并呈一定的濃度依賴性；而Racl、Cdc42mRNA表達(dá)無明顯變化；各濃度PDGF-BB刺激后大鼠肝星狀細(xì)胞RhoA、Cdc42、RaclmRNA表達(dá)無明顯差異。 2．westernblot檢測結(jié)果顯示，不同濃度TGFβ1。、PDGF

8、-BB對大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)RhoA總蛋白表達(dá)均無明顯影響。 3．GSTpulldown結(jié)果顯示：與對照組相比，TGFβ1刺激后活性的Cdc42、RhoA蛋白增加而活性Racl蛋白的表達(dá)無明顯改變；不同濃度PDGF-BB刺激大鼠HSC后，活性Cdc42、Racl、RhoA蛋白均增加，三種活性蛋白表達(dá)均在PDGF-BB濃度達(dá)到long／ml時達(dá)到最高值，再增加濃度蛋白表達(dá)不隨之升高。 結(jié)論：TGFβ1調(diào)節(jié)大鼠HSC肌動蛋白骨架

9、系統(tǒng)可能主要通過Cdc42、RhoA蛋白而非Racl蛋白，而PDGF一明則可能通過Cdc42、Racl、RhoA蛋白的作用。提示RhoGTP酶可能為HSC活化及遷移的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)。 第三部分 RhoA在大鼠ttSC遷移及細(xì)胞骨架構(gòu)建中的作用 目的：觀察RhoA突變對HSC遷移及細(xì)胞骨架改變的影響及PDGF-BB、TGFβ1的干預(yù)作用，為肝纖維化的基因治療尋求新的途徑。 方法：將含RhoA突變基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)

10、染大鼠HSC構(gòu)建野生型、活化突變型及顯性負(fù)突變型RhoA肝星狀細(xì)胞，Westernblot檢測轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞RhoA表達(dá)。用改良的TranswellChamber觀察I型膠原、生長因子(TGFβ1、PDGF-BB)直接及趨化刺激后轉(zhuǎn)染細(xì)胞遷移改變，免疫熒光標(biāo)記肌動蛋白細(xì)胞骨架，共聚焦激光掃描顯微鏡觀察TGFβ1、PDGF-BB誘導(dǎo)后細(xì)胞骨架的變化。 結(jié)果： 1．Westernblot檢測顯示與未轉(zhuǎn)染的HSC相比，轉(zhuǎn)染活化

11、突變型、野生型RhoA的HSC中RhoA蛋白表達(dá)明顯增加，轉(zhuǎn)染顯性負(fù)突變型RhoA的HSC中RhoA蛋白表達(dá)明顯減少。 2．野生型RhoA轉(zhuǎn)染細(xì)胞組生長因子刺激后應(yīng)力纖維及偽足形成與未轉(zhuǎn)染組相似；PDGF-BB、TGFβ1刺激后活化突變型RhoA轉(zhuǎn)染的HSC可見應(yīng)力纖維隨時間延長而明顯增加、增粗，細(xì)胞周圍粘著斑形成增加，而絲狀偽足及板狀偽足形成無明顯變化；與此相反，顯性負(fù)突變型RhoA轉(zhuǎn)染HSC在刺激后未見應(yīng)力纖維及粘著斑的出現(xiàn)