LM的InlC、InlB等毒力蛋白與BMEC的cDNA文庫中互作蛋白的篩選和鑒定.pdf

1、單核細(xì)胞增多李斯特菌(Listeria monocytogenes，LM)被WHO列為4大食源性致病菌之一，是人畜共患李斯特菌病的主要病原菌，LM可穿越宿主血腦屏障引發(fā)人和動物的腦炎，病死率可達(dá)20-70％，但LM穿越血腦屏障的機制尚未闡明。在前期研究中，實驗室從一只神經(jīng)癥狀患病綿羊腦內(nèi)分離得到一株LM，將其命名為LM90。本研究采用分裂泛素化酵母雙雜交系統(tǒng)篩選LM90株Inlc、Ami等表面蛋白與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的捕獲蛋白，

2、并利用免疫共沉淀方法驗證酵母雙雜交篩選到的捕獲蛋白，揭示這些捕獲蛋白在LM侵染人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞過程中的作用機制，為進(jìn)一步闡明LM穿越血腦屏障的分子機理以及篩選針LM的藥物靶點提供科學(xué)依據(jù)。
　　1利用分裂泛素化酵母雙雜交體系篩選捕獲蛋白
　　為了篩選LM的毒力因子內(nèi)化素蛋白家族(Internalin，Inl)、自溶素(Auto)、酰胺酶(Ami)與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的捕獲蛋白，用已轉(zhuǎn)化有pBT3-N-InlC、pDH

3、B1-InlB、pDHB1-InlJ、pDHB1-Ami、pDHB1-Auto的酵母NMY51再轉(zhuǎn)化人/鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的cDNA文庫質(zhì)粒，利用分裂泛素化酵母雙雜交系統(tǒng)(splti-ubiquitinyeast two hybrid)，篩選在酵母NMY51中共表達(dá)并相互作用蛋白，對編碼捕獲蛋白的文庫質(zhì)粒進(jìn)行純化、鑒定，測序分析獲得編碼prey蛋白基因的序列。結(jié)果表明共篩選到與InlC相互作用的假定捕獲蛋白基因6個，與Ami相互作用的假

4、定捕獲蛋白基因4個。本實驗為利用免疫共沉淀方法驗證LM的毒力因子與捕獲蛋白之間的相互作用奠定基礎(chǔ)。
　　2構(gòu)建誘餌蛋白和假定捕獲蛋白基因真核表達(dá)載體
　　為了構(gòu)建誘餌蛋白和假定捕獲蛋白基因真核表達(dá)載體及在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)，采用RT-PCR、PCR方法，擴增誘餌蛋白和cDNA文庫中假定捕獲蛋白以及假定捕獲蛋白CDS區(qū)基因，誘餌蛋白和假定捕獲蛋白基因分別與真核表達(dá)載體pCMV、pACGFP連接。采用Lipofactami

5、ne2000轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，熒光顯微鏡檢測綠色熒光；判斷GFP蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明：成功構(gòu)建真核表達(dá)載體16個，其中捕獲蛋白基因真核表達(dá)載體為14個：H1-pACGFP、H6-pACGFP、H9-pACGFP、H11-pACGFP、H12-pACGFP、A7-pACGFP、A24-pACGFP、A45-pACGFP；CDSH6-pACGFP、CDSH7-pACGFP、CDSH9-pACGFP、CDSH11-pACGFP、CDS

6、H12-pACGFP、CDSA7-pACGFP；誘餌蛋白表達(dá)載體為2個：Ami-pCMV-HA、InlC-pCMV-HA，轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24 h后，捕獲蛋白基因真核表達(dá)載體在熒光顯微鏡下可見綠色熒光，表明GFP蛋白表達(dá)，重組真核表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入HEK293，本研究為單增李斯特菌與腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫中相互作用蛋白的鑒定奠定了基礎(chǔ)。
　　3免疫共沉淀驗證假定捕獲蛋白
　　為了驗證LM的毒力因子Ami、InIc與假

7、定捕獲蛋白之間的相互作用，本試驗利用免疫共沉淀、Western-blot方法對前期篩到的假定捕獲蛋白進(jìn)行進(jìn)一步篩選驗證。結(jié)果表明：CDSH9-pACGFP和InlC-pCMV-HA共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取物以及H9-pACGFP和InlC-pCMV-HA共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞提取物，WB染色后分別在101 KDa及78 KDa附近出現(xiàn)預(yù)計大小的相互作用條帶，提示人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的ACTG1與LM的InIC毒力因子發(fā)生互作。
　　試驗結(jié)果為分析毒力