誘導(dǎo)耐藥K562-ADM和轉(zhuǎn)基因耐藥K562-MDR細(xì)胞株的生物學(xué)行為和耐藥機(jī)制的比較研究.pdf

1、目的:該研究以慢性髓細(xì)胞白血病急性紅白變細(xì)胞系K562,相應(yīng)的阿霉素耐藥細(xì)胞株K562/ADM和轉(zhuǎn)mdr1基因的K562/MDR耐藥細(xì)胞株為研究對(duì)象,旨在比較三種細(xì)胞系的生物學(xué)特性及后兩者耐藥機(jī)制的異同.探討K562/MDR細(xì)胞株作為單機(jī)制耐藥模型的可行性,為進(jìn)一步研究腫瘤耐藥及其逆轉(zhuǎn)奠定基礎(chǔ).方法:實(shí)驗(yàn)分為三部分:(1)觀察K562、K562/ADM和K562/MDR三種細(xì)胞系的生物學(xué)行為.在光學(xué)和電子顯微鏡下分別對(duì)三種細(xì)胞系的形態(tài)學(xué)

2、進(jìn)行觀察;同時(shí)測(cè)定三種細(xì)胞系的群體倍增時(shí)間;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)三種細(xì)胞系的細(xì)胞周期時(shí)相分布;計(jì)數(shù)三種細(xì)胞系的染色體數(shù)目;來(lái)觀察藥物誘導(dǎo)和基因轉(zhuǎn)移是否對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為造成影響.(2)以K562細(xì)胞為對(duì)照,比較K562/ADM和K562/MDR兩種細(xì)胞株的耐藥性并應(yīng)用三氧化二砷(As<,2>O<,3>)對(duì)其進(jìn)行初步逆轉(zhuǎn).MTT法分別測(cè)定三種細(xì)胞系對(duì)As<,2>O<,3>和IC<,50>和低毒劑量,三種細(xì)胞系對(duì)阿霉素(ADM)、柔紅霉素(D

3、NR)和長(zhǎng)春新堿(VCR)和IC<,50>和加入低毒劑量的As<,2>O<,3>后的IC<,50>,比較K562/ADM和K562/MDR兩者的耐藥性、耐藥譜和As<,2>O<,3>的逆轉(zhuǎn)效果.(3)與多藥耐藥相關(guān)的基因與蛋白的檢測(cè).免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)mdr1基因編碼的P-糖蛋白(P-gp)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST-π)基因編碼的GST-π的表達(dá)變化,并用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)對(duì)GST-π進(jìn)行半定量分析,流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)P-gp、bc

4、l-2的表達(dá);生化法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSTs和拓?fù)洚悩?gòu)酶(topoⅡ)活性的變化;RT-PCR法檢測(cè)topoⅡmRNA水平的表達(dá)變化;以比較K562/ADM和K562/MDR兩種細(xì)胞株耐藥機(jī)制在分子水平上的差異.結(jié)論:1.與對(duì)比療藥物敏感的細(xì)胞系K562相比,K562/MDR形態(tài)和增殖特性與K562相似;K562/ADM的增殖減慢,遺傳物質(zhì)染色體的數(shù)目也發(fā)生了改變.說(shuō)明化療藥物的誘導(dǎo)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了損傷.2.K562/ADM和K562/MDR對(duì)A

5、s<,2>O<,3>不具耐藥性,K562/ADM對(duì)As<,2>O<,3>的敏感性強(qiáng)于K562和K562/MDR;K562/ADM的藥物耐受程度高于K562/MDR,但二者有較為一致的交叉耐藥譜,低毒劑量的As<,2>O<,3>可逆轉(zhuǎn)兩細(xì)胞的耐藥.3.與K562比較,K562/ADM細(xì)胞中P-gp、GSP-π呈過表達(dá),bcl-2表達(dá)增高,topoⅡ的編碼基因發(fā)生點(diǎn)突變;而K562/MDR細(xì)胞中除轉(zhuǎn)導(dǎo)基因mdr1編碼的P-gp表達(dá)較K562