雞白痢沙門菌△fur△speDE的構建及其免疫生物學特性初步研究.pdf

1、雞白痢沙門菌（Salmonella enterica serovar Pullorum）是一類禽致病性革蘭陰性桿菌。雛雞感染后表現(xiàn)為急性敗血癥，以拉白色粥樣或黏性糞便為特征，呈現(xiàn)高發(fā)病率和高死亡率。成年雞感染后表現(xiàn)為隱性帶菌或慢性經(jīng)過，不造成死亡。雞白痢沙門菌不僅能夠水平傳播，還可以經(jīng)蛋垂直傳播，導致了雞蛋孵化率的降低和雛雞死亡率的升高。在許多發(fā)展中國家，雞白痢沙門菌仍是家禽養(yǎng)殖業(yè)中危害嚴重的細菌之一，造成了巨大的經(jīng)濟損失。為控制雞白痢

2、，國內外采取了一系列措施，包括疫苗免疫、抗生素治療、檢疫淘汰和生物安全措施等。多年實踐表明，在特定情況下，疫苗接種是防控雞群雞白痢的最有效措施之一。用于防控沙門菌的疫苗主要分為滅活疫苗、亞單位疫苗和減毒活疫苗三種，而減毒活疫苗以其安全性好、穩(wěn)定性強、在減毒的同時不喪失免疫原性等優(yōu)點，被認為是較為理想的疫苗。
　　良好的減毒活疫苗必須保持細菌毒力和免疫保護效力之間的平衡，因此，利用基因工程構建減毒活疫苗的關鍵在于靶基因的選擇。本文選

3、擇fur和speDE基因作為減毒靶基因，利用λ-red同源重組系統(tǒng)，構建了雞白痢沙門菌S06004△fur△spe DE基因缺失株，并對其生物學特性進行了評價，初步探討了該基因缺失株作為減毒活疫苗的可行性。
　　1雞白痢沙門菌fur△peDE基因缺失株的構建及其LD50測定
　　本研究成功構建了雞白痢沙門菌S06004△fur△spe DE基因缺失株。PCR鑒定和測序結果表明，fur和speDE基因敲除成功。與野生株相比，S

4、06004 fur△speDE的部分生物化學特性發(fā)生了改變，且S06004△fur△speDE的生長速度慢于野生株的生長速度。通過遺傳穩(wěn)定性分析，S06004△fur△speDE連續(xù)傳至50代后，缺失的基因不能夠再回復。以海蘭白品系雛雞為動物模型，對S06004△fur△speDE進行毒力評價，結果表明，與野生株相比，S06004△fur△spe DE的LD50提高了約105倍，而S06004△fur口S06004△spe DE的LD5

5、0僅分別提高了約73.4倍和4.95倍。這些結果說明speDE和fur基因的缺失造成了雞白痢沙門菌S06004毒力的下降，S06004△fur△speDE具有良好的安全性，可作為減毒活疫苗候選株進行后續(xù)研究。
　　2減毒雞白痢沙門菌△fur△speDE免疫生物學特性初步研究
　　本研究通過細胞和雛雞模型初步評價了S06004△fur△speDE的免疫生物學特性。以S06004△fur△speDE和野生株分別感染禽巨噬細胞HD

6、-11后發(fā)現(xiàn)，S06004△fur△speDE對細胞的黏附能力與野生株相比無顯著差別，但侵襲細胞及在細胞內增殖的能力顯著降低(P＜0.05)?；蛉笔е暝跈C體內消減動態(tài)的分析及其免疫保護效力的評價結果顯示，S06004△fur△speDE以口服和肌肉注射2種途徑分別免疫3日齡雛雞后，在口服組中，免疫10天后S06004△fur△speDE在肝臟和脾臟中被清除，而肌注組在免疫21天后，S06004△fur△speDE在肝臟和脾臟中被清除。

7、S06004△fur△speDE以口服和肌注2種方式分別免疫3日齡雛雞2周后，再分別以口服和肌注方式攻毒，結果顯示，S06004△fur△spe DE以2種方式免疫2周后，能夠對野生菌攻毒提供100％免疫保護，其體重凈增量也比未免疫組有所提高;肝臟和脾臟病理切片顯示，組織病變程度明顯輕于未免疫組。間接ELISA檢測血清中IgG抗體和黏膜IgA抗體的產(chǎn)生水平，結果顯示S06004△fur△speDE能誘導機體產(chǎn)生較高水平的IgG抗體和Ig