促甲狀腺激素調(diào)節(jié)肝臟膽固醇轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究.pdf

1、隨著人們生活方式的轉(zhuǎn)變，高脂血癥的患病率逐年增高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國≥20歲人群中，高膽固醇血癥的患病率為9.0％，臨界性高膽固醇血癥的患病率為22.5％。甲狀腺功能異常經(jīng)常伴隨有血脂水平的紊亂，傳統(tǒng)理論認(rèn)為甲狀腺功能異常時(shí)膽固醇水平的改變是甲狀腺激素作用結(jié)果，如甲狀腺功能減退(甲狀腺激素降低，促甲狀腺素(thyrotropin，TSH)升高）常合并有高膽固醇血癥，而甲狀腺功能亢進(jìn)（甲狀腺激素升高，TSH降低）則常伴有血膽固醇濃度的降低。<

2、br>　　越來越多的臨床研究證實(shí)血清TSH與膽固醇水平正相關(guān)。肝臟是人體進(jìn)行膽固醇代謝最重要的器官。我們的前期研究證實(shí)肝細(xì)胞表面有功能性的TSH受體表達(dá)，并且TSH可以通過cAMP/PKA/CREB途徑上調(diào)肝臟膽固醇合成限速酶HMG-CoA還原酶的表達(dá)，從而增加膽固醇的合成。
　　肝臟膽固醇代謝除膽固醇合成外，還包括很重要的一個(gè)方面——膽固醇的轉(zhuǎn)化。膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸是體內(nèi)清除過多膽固醇的主要方式，體內(nèi)約50％的膽固醇通過膽汁酸合

3、成代謝排出體外。我們前期的研究證實(shí)TSH升高肝臟細(xì)胞內(nèi)膽固醇的含量升高，那么TSH在增加膽固醇合成的同時(shí)，是否對(duì)膽固醇的轉(zhuǎn)化也有影響呢？目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。
　　關(guān)于甲狀腺功能對(duì)膽汁酸影響的研究甚少。PAULETZKI發(fā)現(xiàn)與甲狀腺功能正常人群相比甲亢患者膽酸(cholic acid，CA)合成速率減少34％(5.8±2.8 vs7.9±4.2，P＜0.02)，膽汁酸中CA/CDCA比值降低(0.57±0.13 vs1.19±0.

4、32，P＜0.01)。而Kosuge發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常人血清，甲亢患者總膽汁酸增加，而甲減降低，雖然無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義但有變化的趨勢(shì);該研究也發(fā)現(xiàn)甲狀腺功能異常時(shí)膽汁酸的成分發(fā)生了變化，甲減患者DCA+CA/LCA+CDCA的值增高(1.45±0.42 vs0.95±0.48，P＜0.01)，甲亢患者該比值降低(0.50±0.19 vs0.95±0.48，P＜0.05)。這兩項(xiàng)研究均提示甲狀腺疾病中TSH和/或甲狀腺激素變化與膽汁酸水平及其成分相

5、關(guān)。膽固醇7a-羥化酶(CYP7A1)是膽汁酸合成經(jīng)典途徑的限速酶。TiangangLi研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CYP7A1的小鼠膽囊中膽汁的主要成分由膽酸(57％)轉(zhuǎn)變?yōu)轾Z脫氧膽酸(54％)，提示甲狀腺功能異常時(shí)膽汁酸成分的改變可能是由CYP7A1活性的改變引起的。Sauter報(bào)道引起甲亢和甲減患者膽汁酸變化的原因可以排除甲狀腺激素的作用，進(jìn)一步提示TSH極有可能通過CYP7A1調(diào)節(jié)膽汁酸代謝。
　　本研究擬通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究集中論證

6、TSH通過肝臟TSHR調(diào)控膽固醇轉(zhuǎn)化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，闡明其病理生理學(xué)分子特征，建立TSH調(diào)控膽固醇轉(zhuǎn)化的分子信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，為認(rèn)識(shí)TSH與肝臟膽固醇轉(zhuǎn)化之間的生物學(xué)功能聯(lián)系和探究甲狀腺疾病膽固醇代謝異常的發(fā)生機(jī)制提供證據(jù)和新思路。
　　研究目的:
　　闡明TSH在肝臟對(duì)膽固醇分解限速酶CYP7A1的影響以及其作用機(jī)制，進(jìn)一步揭示TSH對(duì)膽固醇代謝的調(diào)節(jié)作用，完善甲狀腺疾病時(shí)膽固醇代謝異常的發(fā)生機(jī)制。
　　研究方法:
　

7、　1.在體外實(shí)驗(yàn)，用牛TSH處理肝細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞CYP7A1表達(dá)。用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)人HepG2細(xì)胞，不同濃度TSH刺激HepG2細(xì)胞不同時(shí)間，觀察TSH與細(xì)胞CYP7A1表達(dá)及膽汁酸含量的量效和時(shí)效關(guān)系。。
　　2.為了進(jìn)一步研究TSH與膽固醇轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系，我們通過手術(shù)切除大鼠甲狀腺建立了甲減大鼠模型。該模型突出優(yōu)點(diǎn)是可根據(jù)需要人工控制體內(nèi)甲狀腺激素和TSH水平。不但能排出甲狀腺激素的效應(yīng)，而且能準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)外源性TSH對(duì)大鼠膽

8、固醇代謝的影響。術(shù)后血清TT4≤1.41ng/ml確認(rèn)為完全切除甲狀腺切除大鼠甲狀腺，共獲得手術(shù)摘除甲狀腺組大鼠48只，同時(shí)設(shè)假手術(shù)組（30只）作為對(duì)照。
　　3.為表明TSH影響肝細(xì)胞CYP7A1的表達(dá)是通過TSHR作用的，我們建立的TSHR敲除小鼠模型，由于TSHR的缺失，TSHR敲除小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的甲減，為了排除甲狀腺激素的影響，我們?cè)谛∈箫暳现刑砑蛹谞钕偌に?，以維持小鼠正常的甲狀腺激素水平，觀察TSHR敲除小鼠與野生型小鼠

9、膽汁酸代謝相關(guān)指標(biāo)的變化。另外，我們采用慢病毒包被的shRNA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，抑制TSHR表達(dá)，檢測(cè)TSH刺激后CYP7A1的表達(dá)及膽汁酸含量的變化。
　　4.檢測(cè)TSHR受體基因敲除小鼠肝臟CYP7A1主要調(diào)節(jié)因子的變化，篩選在TSH調(diào)節(jié)CYP7A1表達(dá)過程中可能發(fā)揮作用的調(diào)控因子
　　5.為了證實(shí)TSH抑制肝細(xì)胞CYP7A1mRNA表達(dá)是通過抑制HNF-4α與CYP7A1啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合能力實(shí)現(xiàn)的，本研究設(shè)計(jì)相應(yīng)的包含

10、有HNF-4α結(jié)合位點(diǎn)(HNF-4α-RE)的CYP7A1啟動(dòng)子的一個(gè)DNA片段以及其相應(yīng)的突變對(duì)照DNA片段，與熒光素酶基因融合，構(gòu)建熒光素酶報(bào)告基因，然后轉(zhuǎn)染到HepG2細(xì)胞。在不同處理?xiàng)l件下，測(cè)定熒光素酶活性。
　　6.為了探討TSH對(duì)CYP7A1表達(dá)的影響是否通過cAMP/PKA信號(hào)系統(tǒng)，我們應(yīng)用PKA抑制劑H89和腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536預(yù)孵肝細(xì)胞，再用TSH刺激肝細(xì)胞，檢測(cè)cAMP和CYP7A1變化。
　

11、　7.研究發(fā)現(xiàn)阻斷cAMP/PKA通路并不能完全消除TSH對(duì)CYP7A1的影響，我們進(jìn)一步探討PI3K/Akt信號(hào)通路的作用。我們應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002預(yù)孵肝細(xì)胞，再用TSH刺激肝細(xì)胞，檢測(cè)Akt通路相關(guān)指標(biāo)和CYP7A1變化，并進(jìn)一步探討TSH通過PI3K/Akt通路調(diào)節(jié)CYP7A1的具體機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1.TSH在體內(nèi)與體外均可抑制肝細(xì)胞CYP7A1的表達(dá)和活性
　　(1)不同濃度bTSH對(duì)

12、CYP7A1蛋白的影響
　　與正常對(duì)照組比，用1μM和4μM bTSH分別處理細(xì)胞后，CYP7A1蛋白表達(dá)分別下降了23％和52％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)。說明bTSH可劑量依賴性地下調(diào)CYP7A1蛋白水平。
　　(2)不同濃度bTSH刺激對(duì)CYP7A1 mRNA水平的影響
　　與正常對(duì)照組相比，CYP7A1的mRNA表達(dá)分別下降了33％和61％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。說明bTSH可

13、劑量依賴性地下調(diào)CYP7A1 mRNA水平。
　　(3)雄性Wistar大鼠分別進(jìn)行甲狀腺摘除術(shù)(Tx)或假手術(shù)。Tx大鼠給予注射T4和不同劑量的bTSH。在每天注射外源性T4后，與假手術(shù)組比，Tx大鼠血清T4水平并無顯著差異(p＞0.05)。但是，與僅注射T4的大鼠相比，Tx同時(shí)注射外源性TSH和T4會(huì)顯著增加血清TSH水平，Tx大鼠補(bǔ)充TSH后，血清TC水平升高，同時(shí)血清和肝臟中TBAs水平下降，呈量效關(guān)系。作為BAs合成限速

14、酶的CYP7A1蛋白水平和活性在補(bǔ)充TSH后也呈劑量依賴性下降。
　　2.TSH由TSHR介導(dǎo)抑制CYP7A1表達(dá)減少膽汁酸合成
　　(1) TSHR敲除小鼠肝臟CYP7A1以及膽汁酸含量的變化:與野生型小鼠相比，TSHR受體敲除小鼠在補(bǔ)充甲狀腺激素后，血清甲狀腺激素水平無明顯差異，血清總膽汁酸，膽汁酸池，肝臟膽汁酸含量，膽囊膽固醇含量以及糞便膽汁酸排泄率均增加，而相應(yīng)的CYP7A1蛋白及mRNA水平也顯著增加。
　　

15、(2)慢病毒介導(dǎo)的TSH受體RNA干擾:TSHR-RNAi-lentivirus轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞可以顯著降低肝細(xì)胞TSHR的表達(dá)，而TSH對(duì)肝細(xì)胞CYP7A1表達(dá)以及膽汁酸含量的抑制作用消失。
　　(3)尾靜脈注射TSHR-SiRNA對(duì)小鼠肝臟CYP7A1以及膽汁酸含量的變化:與注射PBS組小鼠相比，尾靜脈高壓動(dòng)力注射TSHR-siRNA可以顯著抑制肝臟TSHR的表達(dá)，而對(duì)甲狀腺功能沒有影響，肝臟CYP7A1的表達(dá)以及血清總膽汁

16、酸水平顯著增加。
　　3.TSH通過HNF-4α調(diào)控CYP7A1表達(dá)
　　(1)與野生型小鼠相比，TSHR受體敲除小鼠FXR、LRH-1，PXR，F(xiàn)GFR4，β-Klotho等分子的mRAN水平均無明顯變化。
　　(2) HNF-4α是肝臟內(nèi)含量最豐富的核受體，其已被證實(shí)在CYP7A1的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，我們發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，TSHR受體敲除小鼠HNF-4αmRNA水平明顯增加。
　　(3)報(bào)告基因結(jié)果:H

17、epG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染包含有HNF-4α結(jié)合位點(diǎn)的CYP7A1啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段的報(bào)告基因質(zhì)粒，再用TSH刺激，可以顯著降低細(xì)胞的熒光素酶活性，而當(dāng)把HNF-4α結(jié)合位點(diǎn)突變之后，TSH對(duì)熒光素酶活性的抑制效應(yīng)消失，說明TSH確實(shí)通過影響HNF-4α與CYP7A1啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合調(diào)節(jié)CYP7A1的表達(dá)。
　　4、TSH通過cAMP/PKA信號(hào)通路增加HNF-4α磷酸化
　　(1)我們前期研究發(fā)現(xiàn)TSH通過TSHR增加cAMP的產(chǎn)量

18、，而有研究發(fā)現(xiàn)cAMP通過PKA通路增加HNF-4α磷酸化從而抑制HNF-4α與CYP7A1啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合。我們研究發(fā)現(xiàn)TSH刺激可引起HepG2 HNF-4α磷酸化明顯增加。
　　(2)我們應(yīng)用PKA抑制劑H89或者腺苷酸環(huán)化酶抑制劑(SQ22536)處理肝細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其都僅能夠部分而非完全逆轉(zhuǎn)TSH對(duì)CYP7A1的抑制作用，表明除了cAMP/PKA信號(hào)通路外還有其他通路在TSH介導(dǎo)的抑制CYP7A1機(jī)制中發(fā)揮作用。
　　5

19、、TSH通過PI3K/Akt/SREBP-2通路抑制核內(nèi)HNF-4α的表達(dá)
　　(1) TSH處理HepG2細(xì)胞可劑量依賴性的增加p-Akt水平。
　　(2)應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002處理HepG2細(xì)胞可以顯著消除TSH對(duì)肝臟HNF-4α以及CYP7A1的影響。
　　(3)TSH可通過PI3K/Akt通路劑量依賴性的增加HepG2細(xì)胞SREBP-2的表達(dá):TSH處理HepG2細(xì)胞可劑量依賴性的增加SREBP-2

20、蛋白的表達(dá)，應(yīng)用PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理處理HepG2細(xì)胞后TSH對(duì)SREBP-2的效應(yīng)消失。
　　(4)SREBP-2對(duì)HNF-4α與CYP7A1的調(diào)節(jié)作用:HepG2細(xì)胞共轉(zhuǎn)染包含有HNF-4α結(jié)合位點(diǎn)的CYP7A1啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段的報(bào)告基因質(zhì)粒以及SREBP-2過表達(dá)質(zhì)粒，可以顯著降低細(xì)胞的熒光素酶活性，而共轉(zhuǎn)染HNF-4α結(jié)合位點(diǎn)突變質(zhì)粒以及SREBP-2過表達(dá)質(zhì)粒，細(xì)胞的熒光素酶活性無明顯變化，說明SRE

21、BP-2可以調(diào)節(jié)HNF-4α與CYP7A1的結(jié)合。
　　(5) TSH通過PI3K/Akt/SREBP-2通路調(diào)節(jié)HNF-4α:應(yīng)用SREBP-2 siNRA轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞顯著抑制SREBP-2蛋白表達(dá)，再用TSH刺激，TSH對(duì)HNF-4α和CYP7A1的抑制作用得到一定程度的恢復(fù)。
　　結(jié)論:
　　1、本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，證明了TSH可以抑制肝臟膽固醇轉(zhuǎn)化的限速酶CYP7A1的表達(dá)，并且通過一系